ARMS-PCR技术在玫瑰果鉴别中的应用_邵婕.pdf

161 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 1 期ARMS-PCR技术在玫瑰果鉴别中的应用邵婕1，杨正修1，邹强1，陆峥飞2，李凡1*1.康宝莱蕾硕（湖南）天然产物有限公司（长沙 410100）；2.康宝莱全球测试中心HP1实验室（托伦斯 90502）摘要玫瑰果(Rosa canina)是维生素C的重要来源,被广泛用于各种食品和膳食补充剂。刺玫果(Rosa davurica)原产于中国,与玫瑰果属于同一植物属,由于其果实表现出与玫瑰果相似的物理外观和植物化学特征,因此区分玫瑰果和刺玫果具有挑战性。开发一种用于玫瑰果原料鉴定的扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应方法(ARMS-PCR)。与物种特异性PCR相比,试验方法可同时靶向检测玫瑰果及其近亲物种刺玫果。经双盲试验验证该检测方法对玫瑰果的识别概率大于0.9(95%CI),并证明检测刺玫果的最低检测限为10%。综上所述,该检测方法可用于快速鉴别玫瑰果和刺玫果。关键词玫瑰果;扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应;刺玫果;植物原料Application of ARMS-PCR Technology in Identification of RosehipSHAO Jie1,YANG Zhengxiu1,ZOU Qiang1,LU Zhengfei 2,LI Fan1*1.Herbalife Nat Source(Hunan)Natural Products Co.,Ltd.(Changsha 410100);2.Herbalife Nutrition,Global Quality(Torrance 90502)Abstract Rose hips(Rosa canina)are a great source of vitamin C and are used in a variety of foods and dietary supplements.Rosa davurica is native to China and belongs to the same genus as rose hips.Distinguishing rosehip from Rosa davurica is challenging as their fruits exhibit similar physical appearance and phytochemical characteristics.An amplification retardation mutation system-polymerase chain reaction method(ARMS-PCR)was developed for the identification of rosehip raw materials.Compared with species-specific PCR,this method could simultaneously targeted detect rose hips and its close relative,Rosa davurica.The double-blind experiment verified that the detection method had a recognition probability of rosehip greater than 0.9(95%CI),and proved that the detection sensitivity of rosehip was as low as 10%.The detection method can quickly identify rose hips and thorn rose hips.Keywords Rosa canina;ARMS-PCR;Rosa davurica;plant materials*通信作者玫瑰果（Rosa canina）在世界上有着悠久的药食两用历史。玫瑰果中多酚、黄酮、维生素C等活性物质含量丰富，具有抗氧化、抗癌、抗辐射和抑菌等多种药理作用1。但玫瑰果原料品种繁多，蔷薇属果实的化学成分、抗氧化能力和个体酚类物质含量存在显著差异2。刺玫果（Rosa duvarica）和玫瑰果属于同一植物属，两者不仅在外观上非常相似，活性物质也非常相似，主要包括黄酮、多糖、三萜等3。由于化学成分的相似性，常见的化学鉴定方法难以对二者进行区分，使得玫瑰果掺假特别是混合掺假的检测具有挑战性。扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应（amplification refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR）技术4常用于遗传疾病5、基因分型6和微生物学7等许多快速检测研究领域，在植物鉴定和分析化学中的应用鲜有报道。试验通过对玫瑰果和刺玫果基因组序列的比较分析，建立一种基于特征SNP位点的ARMS-PCR方法，可用于鉴定玫瑰果和刺玫果。1材料与方法1.1材料与设备化学标准品Isoquercetin（ChromaDex ASB-00009505-025）。植物对照药材（Botanical Reference Material，BRM）：玫瑰果果实BRM（Lot 00030792-473，ASB-00030792-005，ChromaDex.Inc）；刺玫果果实BRM（Lot 121255-201203，121255，购自National Institute of Food and Drug Control，NIFDC）。植物材料：从中国原料市场采购11份玫瑰果用于验证。Automatic TLC Sampler 4（Chromacim，Moirans，法国）；硅胶板（60 F254，2010 cm，Merck，德国）；CAMAG TLC可视化仪（Chromacim，Moirans，法国）；DNeasy mericon Food Kit；Qubit 3.0荧光计（Thermofisher，广州，中国）；C1000 Touch（BIO-RAD，上海，中国）；Integrated DNA Technologies（Thermofisher，广州，中国）；AmpliTaq GoldTM 360 食品工业 2023 年第44卷第 1 期 162 研究探讨Master Mix（Thermo Fisher，立陶宛）。1.2高效薄层色谱（high-performance thin layer chromatography，HPTLC）样品处理：称取500 mg玫瑰果或刺玫果果实BRM到15 mL试管中，加入10 mL甲醇，涡旋30 s。超声处理15 min。将一部分样品通过0.45 m滤膜过滤到HPLC进样瓶中。使用Automatic TLC Sampler 4将样品喷涂到预制硅胶板上，Isoquercetin作为化学标准品喷涂到预制硅胶板上。用流动相（乙酸乙酯/乙酸/甲酸/超纯水100/11/11/26）展开，使用10%硫酸进行显色。用 CAMAG TLC可视化仪和Vision cats软件拍摄照片。1.3DNA提取DNA提取过程均根据制造商的说明使用DNeasy mericon Food Kit进行。过程：将50100 mg玫瑰果或刺玫果果实BRM，1 mL Food Lysis Buffer和2.5 L Proteinase K加入离心管中，在60 下孵育30 min，并以2 500g离心5 min；取700 L上清液于新的离心管中，加入500 L氯仿，涡旋15 s，并将混合物以14 000g离心15 min；将350 L上清液转移到新的离心管中，加入350 L PB Buffer，将混合液转移到吸附柱中，以17 000g离心1 min；弃去收集管中溶液；向吸附柱中加入500 L AW2 Buffer，并以17 000g离心1 min；将收集管中的溶液再次倒出，并将吸附柱以17 000g离心2 min；将吸附柱放入新的离心管中，加入100 L TE缓冲液，并将其以17 900g离心2 min；使用Qubit 3.0荧光计进行定量。1.4DNA Barcode序列采集及植物鉴定使用2对引物对玫瑰果和刺玫果gDNA（genomic DNA）进行扩增，扩增体系包含10 L AmpliTaq GoldTM 360 Master Mix、2 L引物混合物（每种引物5 mol/L）、5 L gDNA和3 L Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上进行PCR扩增，反应条件为95 预变性5 min，95 变性30 s（58 退火30 s，72 延伸30 s）35，72 终末延伸3 min。RbcL-F：5-TGTAAAACGACGGCCAGTATGTCACCACAAA-CAGAAAC-3；RbcL-R：5-CAGGAAACAGCTAT-GACCGTAAAA TCAAGKCCACCRCG-3；ITS2-F：5-TGTAAAACGACGGCCAGTATCCGATACTTGGT-GTGAAT-3；ITS2-R：5-CAGGAAACAGCTATGAC-CGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。获得RbcL与ITS2基因片段，通过sanger测序获取序列信息。引物由Integrated DNA Technologies（Thermofisher，广州，中国）合成。双盲试验：将11份玫瑰果市场样品与14份刺玫果果实BRM由试验人员1随机编排顺序并编号，通过DNA barcode技术对25个样品进行鉴定。提取25个样品gDNA后，通过RbcL和ITS2这2对引物对gDNA进行PCR扩增，扩增体系包含10 L AmpliTaq GoldTM 360 Master Mix、2 L引物混合物（每种引物5 mol/L）、5 L gDNA和3 L Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上进行PCR扩增，反应条件为95 预变性5分钟，95 变性30 s（58 退火30 s，72 延伸30 s）35，72 终末延伸3 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果后进行Sanger测序，确认样品种属信息。试验人员2通过ARMS-PCR对25个样品进行鉴别。1.6ARMS-PCR使用AmpliTaq GoldTM 360 Master Mix对玫瑰果与刺玫果的gDNA进行扩增，扩增体系包含10 L AmpliTaq GoldTM 360 Master Mix、2 L引物混合物（每种引物5 mol/L）、5 L gDNA和3 L Free-Nuclease Water。在C1000 Touch上进行PCR扩增，反应条件为95 预变性5 min，95 变性30 s（58 退火30 s，72 延伸30 s）35，72 终末延伸3 min。原始DNA洗脱用于PCR反应，无需调整浓度。每次运行都包括阳性对照和阴性对照，PCR产品在带有DNA染料的2%琼脂糖凝胶中可视化。各基因及其引物的扩增引物序列详见表1。引物由Integrated DNA Technologies合成。GeneForward 5-3Reverse 5-3Outer TCAAACCTCGGTTTCCTGTCGTTCGCTCGCCGTTACTAAGInner TTAAACAATGCGTGTCGATCCCGCGTTGAAAGCATCGACA表1ARMS-PCR引物信息表1.7生物信息学分析从NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载所有序列，从NCBI下载的所有序列在MEGA X中使用ClustalW默认设置进行比对，引物设计使用Primer 3.0 plus（https:/ Aligner和APE软件进行分析。Sanger测序结果在NCBI上进行比对。1.8统计学分析双盲试验所获得的试验数据通过POI（probability of identification）进行分析8。2结果与分析2.1H