CST1调节Notch信号...细胞增殖、迁移和侵袭的影响_刘瑜.pdf

调节 信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 通讯作者，：四川广元 广元市中心医院肿瘤科刘 瑜，杨华清，赵 彬，杜 丽【摘 要】目的 探讨半胱氨酸蛋白酶抑制剂（）调控 信号通路影响非小细胞肺癌（）细胞增殖、迁移和侵袭生物学行为的潜在机制。方法 通过 分析癌症基因图谱（）数据库中 组织的 水平。采用实时荧光定量（）检测 细胞的 水平。向 细胞转染靶向 的小干扰 序列 来评估 对 细胞生物学行为的影响，后续在转染 基础上给予 通路激活剂（）处理来评估 调控 信号通路对 细胞生物学行为的影响，单独给予 通路抑制剂（）处理来验证 信号通路对 细胞生物学行为的促进作用。、划痕实验和 小室实验检测细胞增殖、迁移和侵袭情况。和 检测、发状分裂相关增强子（）和基质金属蛋白酶（）的水平。结果 在 组中的水平高于正常组织（.），且其在、和 细胞中的水平高于 细胞（.）。细胞转染 或经 处理后的增殖活力、划痕愈合率和穿膜数量较对照组细胞降低且伴有 和 的表达下调（.）；细胞经 和 联合处理后的增殖活力、划痕愈合率和穿膜数量较单独转染 的细胞增多且伴有、和 的表达上调（.）。结论 在 组织和细胞中上调且可能通过激活 信号通路在 中发挥促癌作用，其有望成为 治疗的新型生物标志物和潜在治疗靶点。【关键词】非小细胞肺癌；半胱氨酸蛋白酶抑制剂；增殖；侵袭迁移；信号中图分类号：.文献标识码：文章编号：（），：，：【】（），（）（）（），（）（），（）（）（.），（.），（.），临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，（.）【】；肺癌是最常见、最具侵袭性的癌症，也是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（，）是其最为常见类型。尽管传统疗法包括化学疗法、放射疗法、分子靶向疗法和免疫疗法，但在过去 年中，肺癌患者的 年生存率改善甚微。因此，探索新的治疗靶点对于靶向精准诊疗意义重大。半胱氨酸蛋白酶抑制剂（，）基因位于染色体.，属于 型胱抑素（，）超家族，对半胱氨酸蛋白酶有抑制作用。最近被认为与一些特定人类癌症的发展有关，通过、等信号通路促进胃癌、肝细胞癌、乳腺癌细胞的生长与恶性侵袭。有研究发现 与 患者的复发和转移密切相关，然而其中的生物学机制仍需进一步阐明。本研究旨在探讨 在 细胞增殖和侵袭迁移过程中的作用及分子机制，现将结果报告如下。材料与方法.细胞和主要试剂人正常肺上皮细胞 和 细胞（、）购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，条靶向 的小干扰 序列（：；：）和无义序列（）及实时定量（）引物购自通用生物股份有限公司，转染试剂脂质体 购自美国 公司，培养基、胎牛血清、青霉素链霉素混合溶液和胰蛋白酶购自美国 公司，检测试剂盒、逆转录试剂盒 和荧光定量试剂盒 购自诺唯赞生物科技股份有限公司，兔源、发状分裂相关增强子（，）和基质金属蛋白酶（，）多克隆一抗及 标记的羊抗兔二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，信号通路抑制剂 和激活剂 购自上海 公司。.细胞转染 将细胞置于 、恒温培养箱中，用 培养基添加 胎牛血清和 青霉素链霉素常规培养及换液。将生长状态良好的 细胞以 个 孔密度接种于 孔板，细胞生长至 以上更换无血清 培养基。根据转染试剂说明书将 或 转染至 细胞。根据实验设计将 细胞分组如下：空白对照组、阴性对照组、组、通路抑制剂组和 通路激活剂组。通路抑制剂组接受 处理，而 通路激活剂组则在转染 后接受 处理。.总 提取和 检测 法提取细胞的总，取 样品逆转录为，以 为模板根据试剂盒说明书行 检测。以 作为内参，采用 法计算基因相对表达量。上游引物：，下 游 引 物：；上游引物：，下 游 引 物：；上游引物：，下游引物：；上 游 引 物：，下游引物：；上 游 引 物：，下游引物：。.实验 细胞转染、后采用 试剂盒检测不同时间点细胞活力，酶标仪测定 波长处的吸光度值，计算各组细胞增殖活力变化。.划痕实验 将 细胞按照 个 的密度接种至 孔板常规培养。待细胞装满后用灭菌枪头垂直在单层细胞上划线，无血清培养基或 冲洗脱落的细胞碎片，显微镜拍照。常规培养 后冲洗细胞碎片，显微镜拍照，分析划痕 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，内的愈合率，评估各组细胞迁移能力。.小室实验向 小室膜上加入 基质胶稀释液，风干后将小室放入 含 胎牛血清的 培养液上，随后将转染后细胞用 胎牛血清培养基重悬，按照每个小室内接种 个细胞，常规培养 。取出小室用 洗两次，经 多聚甲醛固定和结晶紫染料染色后，光学显微镜拍照，计数穿膜细胞以评估细胞侵袭能力。.检测向 细胞中加入蛋白裂解液 提取细胞总蛋白，用 试剂盒测定样品蛋白浓度。取蛋白样品加入 上样缓冲液煮沸 变性，经 进行电泳 ，湿转法进行转膜，牛血清蛋白中封闭，环境孵育一抗（）并过夜，室温环境孵育二抗（），洗涤两次后加入 显色液避光条件下显影，用化学发光仪曝光并拍照。根据目标条带与内参的灰度值比来计算基因蛋白相对表达量。.在线分析 通过 在 线 网 站（：）对癌症基因组图谱（）数据库中肺腺癌（）和肺鳞癌（）组织及正常组织中的 水平进行分析。.统计学分析采用 .版软件进行统计学处理。数据以均数据标准差表示，实验重复 次及以上，两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以.为差异有统计学意义。结 果.组织的 水平 网站在线分析结果显示，在 和 组织中的水平均高于正常对照组织，差异有统计学意义（.）。见图。：癌组织；：正常组织；与正常组织比较，.图 组织的 水平.细胞的 水平 结果显示：（）在、和 细胞的 水平较 细胞的.分 别 上 调 至.、.、.、.、.和.，差异均有统计学意义（.）；（）空白对照组（.）和阴性对照组（.）细胞中 相对表达量的差异无统计学意义（.）。与 阴 性 对 照 组 相 比，组（.）和 组（.）细胞中 的相对表达量均下调（.），其中 干扰组 转染效果更显著。见图。：和 细胞；：细胞；与 细胞比较，.；与阴性对照组比较，.图 细胞的 水平 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，.转染 对 细胞增殖的影响 结果显示，空白对照组和阴性对照组整个实验阶段 细胞活力的差异无统计学意义（.）；而与阴性对照组比较，转染处理 和 后 组 细胞活力降低（.）。见图。.转染 对 细胞迁移的影响 划痕实验结果显示，空白对照组和阴性对照组 细胞划痕愈合率分别为（.）和（.），差异无统计学意义（.）；而与阴性对照组比较，组 细胞划痕愈合率降低至（.），差异有 统 计 学 意 义（.）。见图。与阴性对照组比较，.图 细胞转染 后的增殖曲线：划痕实验记录图（）；：划痕愈合率；与阴性对照组比较，.图 细胞转染 后迁移能力的评估结果.转染 对 细胞侵袭的影响 小室实验结果显示，空白对照组和阴性对照组的 细胞穿膜数量为（.）个和（.）个，差异无统计学意义（.）；而与阴性对照组比较，组 细胞穿膜数量减少至（.）个，差异有统计学意义（.）。见图。：小室实验记录图（）；：细胞穿膜数量；与阴性对照组比较，.图 细胞转染 后侵袭能力的评估结果.转染 对 细胞 信号通路的影响 和 检测结果显示，空白对照组和阴性对照组 和 和蛋白水平的差异无统计学意义（.）；而与阴性对照组比较，组 和 和蛋白水平均下调（.）。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：水平；：水平；：记录图；：、蛋白水平；与阴性对照组比较，.图 细胞转染 后 信号通路的变化情况.调控 信号通路对 细胞增殖的影响 结果显示，与对照组比较，组和 通路抑制剂组 细胞活力均降低（.）；而与 组相比，通路激活剂组 细胞活力增强（.），且与对照组的差异无统计学意义（.）。见图。.调控 信号通路对 细胞迁移的影响 划痕实验结果显示，组和 通路抑制剂组的 细胞划痕愈合率分别为（.）和（.），较对照组的（.）降低，差异有统计学意义（.）；与 组相比，通路激活剂组 细胞划痕愈合率增加至（.），差异有统计学意义（.），而与对照组的差异无统计学意义（.）。见图。与相应组比较，.图 各组 细胞的增殖曲线：划痕实验记录图（）；：划痕愈合率；与对照组比较，.图 各组 细胞迁移能力的评估结果.调控 信号通路对 细胞侵袭的影响 小室实验结果显示，组和 通路抑制剂组 细胞穿膜数量分别为（.）个和（.）个，较对照组的（.）个减少，差异有统计学意义（.）；而与 组比较，临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，通路激活剂组 细胞穿膜数量增加为（.）个，差异有统计学意义（.），且与对照组的差异无统计学意义（.）。见图。：小室实验记录图（）；：细胞穿膜数量；与对照组比较，.图 各组 细胞侵袭能力的评估结果.调控 信号通路对 细胞相关因子表达的影响 和 结果显示，与对照组比较，组和 通路抑制剂组、和 的 和蛋白水平均降低（.）；而与 组比较，通路激活剂组、和 的 和蛋白水平升高（.），且与对照组的差异无统计学意义（.）。见图。：水平；：水平；：水平；：记录图；：、和 蛋白水平；.图 各组 细胞相关因子表达的评估结果 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，讨 论 是我国最常见的肿瘤类型之一，发病率和死亡率极高，已成为我国重大的公共卫生问题和巨大的社会负担。迄今为止，恶性表型发生和肿瘤进程的潜在机制尚未得到充分研究，导致患者治疗效果不佳，年生存率无法得到改善。属于分泌蛋白，在调节半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性以及炎症和肿瘤发生中起重要作用。大量研究通过多变量分析证实，高表达是多种癌症预后不良的独立指标，其中包括肝细胞癌、胃癌和食管鳞癌等，。有学者通过免疫组织化学分析表明 肿瘤组织中 高水平预示患者预后不良。血清 还可以作为区分早期 和肺良性结节的诊断标志物。本研究中，我们首先通过生物信息学分析发现 在 组织中表达上调，且这种高表达在 细胞中得到验证。为进一步探索 对 细胞生物学行为的影响和调控机制，本研究在 细胞中下调 表达，细胞的增殖活力、迁移和侵袭过程均受到明显抑制，缓解了细胞的恶性表型。先前有研究显示，沉默 表达能够抑制甲状腺乳头状癌细胞的运动能力和上皮间质转化，在体内和体外抑制肿瘤生长，并且影响甲状腺乳头状癌的干细胞特性。敲低 导致 阳性乳腺癌细胞生长减慢并阻滞细胞从 期向 期转变，通过 反馈环在乳腺癌中充当癌基因。上述结果表明 在 中具有致癌活性。信号通路高度保守，在细胞分化、存活、增殖、干细胞更新以及发育、决定细胞命运等方面发挥重要作用，可调节多种组织的正常胚胎发育和体内平衡，并与癌症发生和疾病进展有关。通路具有癌症异质性，根据组织环境 成员可以发挥致癌或抑癌功效。研究显示 的小细胞肺癌中表达 抑制性配体，导致 通路活性缺失；但 在低分化和侵袭性 中 过 度 表 达，发 挥 明 显 的 致 癌 因 子 作用。是 通路最常见受体，其过表达与肺癌进展、患者不良预后以及肺癌细胞增殖密切相关；是 通路作用的下游效应基因。此外，有研究报道 可以激活 信号通路促进 体外生长和转移，参与 的进展。本研究检测发现，细胞中沉默 表达可明显抑制 和 表达，同时下调 表达，因此推测 通路可能在 介导的 恶性发展中发挥重要作用。在 细胞中添加 通路抑制剂，并在沉默 表达的同时添加 通路激活剂，观测细胞肿瘤相关生物学表型变化，结果发现阻断 通路明显抑制了 细胞的增殖、迁移和侵袭过程；相反，通路激活剂明显逆转了由 表达下调引起的对 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，说明 能够通过活化 信号通路来加速 细胞的增殖和转移。这为我们深入探讨 作为癌基因参与 调控提供了新启示。综上所述，本研究表明 在 组织及细胞中表达上调，干扰 表达可能通过抑制 信号通路的活化来调控 细胞的增殖与迁移、侵袭过程。本研究结果为深入了解 的发病机制及探究关键作用靶点提供了新见解。但是本研究仍存在许多局限性，仅局限于在细胞水平进行体外功能探究，今后的研究中我们将考虑构建小鼠模型，在动物水平进一步验证 在肺癌中的作用和分子机制。参考文献 ，：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，：，（）：临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：，：，（）：，（）：，：，：，（