Ames试验与HPRT试验...法对6种氧化型染发剂的检测_陈秀娟.pdf

0 5 7CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS检测研究癌变畸变突变2023 年 1 月第 35 卷第 1 期收稿日期：2022-10-24；修订日期：2023-01-06作者信息：陈秀娟，E-mail：。*通信作者，刘香梅，E-mail：Ames试验与HPRT试验两种方法对6种氧化型染发剂的检测陈秀娟，李培宁，江漪，吴剑辉，黄晓辉，杨云，吴谦，刘香梅*(广州质量监督检测研究院，广东广州511447)Testing of six oxidative hairdyes using the Ames andthe HPRT testsCHEN Xiujuan,LI Peining,JIANG Yi,WU Jianhui,HUANG Xiaohui,YANG Yun,WU Qian,LIU Xiangmei*(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511447,Guangdong,China)【摘要】目的：通过细菌回复突变试验(Ames试验)和体外哺乳动物细胞基因突变试验(HPRT试验)两种方法检测氧化型染发剂，并对其结果进行分析比较，探讨两种方法在检测氧化型染发剂致突变性中的应用。方法：Ames试验采用一组营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌检测6种氧化型染发剂。各受试物分别设4个可供分析的剂量组，剂量范围从31210 000 g/皿，通过计算受试物回复突变菌落数，判定受试物的致突变性。HPRT试验采用体外培养的V79细胞，各受试物分别设4个可供分析的剂量组，剂量范围从4.885 000 g/mL，研究6种氧化型染发剂致细胞HPRT位点突变的频率，通过计算受试物引起的V79细胞的突变频率，判定其致突变性。结果：在Ames试验中，无论加与不加体外代谢活化系统，受试物在2 50010 000 g/皿剂量范围均存在回变菌落数超过溶剂对照组两倍的情况，并有剂量-反应关系，表明Ames试验检测6种氧化型染发剂均为阳性结果。而在HPRT试验中，无论加与不加体外代谢活化系统，各受试物在2 500 g/mL时具有明显毒性作用，在9.752 500 g/mL剂量范围细胞突变频率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义，表明HPRT试验检测6种氧化型染发剂均为阴性结果。结论：由于氧化型染发剂有明显的细胞毒性，导致HPRT试验无法设计更高的剂量，从而无法反映受试物致突变性的真实水平。而Ames试验具有简单、快速、经济等优点，可作为检测氧化型染发剂致突变性的首选方法。【关键词】Ames试验；回复突变；HPRT试验；基因突变；氧化型染发剂中图分类号：S859.83文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)01-0057-06doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.01.011【ABSTRACT】OBJECTIVE：To use the Ames and the HPRT tests，six oxidative hair dyes were tested，andapplicationofthetwomethodsindetectingmutagenicityofoxidativehairdyeswasdiscussed.METHODS：Four dose groups，ranging from 312 to 10 000 g/dish were set up for the Ames test.mutagenicity was determined by calculating the numbers of reverted mutant colonies.In the HPRT test，V79cells were cultured in vitro，and 4 dose groups were set up for analysis，with the dose range from 4.88 to5 000 g/mL，to determine mutation frequencies of the HPRT sites.RESULTS：With or without an in vitrometabolic activation system in the Ames assay，the numbers of retroactive colonies in the treated groups weremore than twice that of the solvent control group，and there was a dose-effect relationship.However，therewas no statistically significant difference in cell mutation frequencies between the treated and the control groupwith or without the metabolic activation system.CONCLUSION：Due to cytotoxicity of the oxidative hair dyesto mammalian cells，the HPRT test was not capable of detecting mutagenicity of the hair dyes.Thus，theAmes test which is simple，rapid and economical，and can be used as the first choice for mutagenicity test.【KEY WORDS】Ames test；reverse mutation；HPRT test；gene mutatio；oxidative hair dye染发剂是可以用来改变头发颜色以达到美容为目的的化妆品，主要由染料、稳定剂、氧化剂等组成1。根据是否发生氧化反应分为氧化型染发剂和非氧化型染发剂，氧化型染发剂具有染色效果好、持色检测研究癌变畸变突变0 5 8CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.1Jan.2023时间长、色调范围广且色泽相对比较自然的优点，是当前染发剂市场的主流产品，但其毕竟是化学合成的物质，而且染发过程实质也是化学反应的过程，有可能会引起皮肤过敏、毛囊损伤等副作用，甚至还有致癌的风险2，其对健康的影响越来越受到人们的重视。我国的化妆品监督管理条例中把染发剂列为特殊化妆品进行管理，而氧化型染发剂须经过致突变性检验，包括细菌回复突变试验(即Ames试验)和体外哺乳动物细胞基因突变试验。本文选用分析HPRT位点突变方法进行体外哺乳动物细胞基因突变试验，以下称HPRT试验。通过Ames试验和HPRT试验两种方法检测6种国内外生产的氧化型染发剂，并对其结果进行分析比较，探讨两种方法在氧化型染发剂中致突变性检测中的应用。1材料与方法1.1材料1.1.1受试物受试物为 6 种氧化型染发剂，其中1、2、3号样为广东某生产企业送检产品，4、5、6号样为某代理商送检的进口产品。受试物均为A、B两剂型的无菌未开封独立包装产品，A剂均为膏状物，B剂均为黏稠乳液。试验前，在无菌条件下，按产品使用说明书的比例要求，将A、B两剂混合均匀后，称取5.0 g以灭菌水配制成100.0 mg/mL的混悬液，再逐级2倍稀释制成一系列的受试物，浓度范围从3.12100.0 mg/mL，用于Ames试验。另称取A、B两剂混合物5.0 g，以无血清MEM培养基配制成100.0 mg/mL的混悬液，同样逐级2倍稀释制成一系列的受试物，浓度范围从0.048 8100.0 mg/mL，用于HPRT试验。1.1.2试验菌株鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102 和 TA153 菌株，购自美国MOLTOX公司，贮存于4 冰箱。1.1.3细胞株中国仓鼠肺细胞株V79，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，贮存于液氮中。V79细胞培养于37、CO2体积分数为5%的二氧化碳培养箱，采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素的MEM培养液。1.1.4主要试剂和阳性对照琼脂粉购于北京三药科技开发公司；营养肉汤购于广东环凯微生物科技有限公司；HPRT试剂盒，购自北京汇智泰康医药有限公司。MEM 培养基和胎牛血清，均购于美国 Gibco 公司；大鼠肝匀浆上清液(S9)，购于江苏齐氏生物科技有限公司。叠氮钠和2-氨基芴均购于美国Sigma Aldrich公司；敌克松购于美国ChemService公司；1,8-二羟基蒽醌购于阿拉丁试剂有限公司；2-氨基蒽购于日本TCI公司。1.1.5主要仪器全自动Ames实验仪购于北京慧荣和科技有限公司；生化培养箱及二氧化碳培养箱购于美国SHELLAB公司；抑菌圈测量及菌落计数仪购于杭州迅数科技有限公司的Czone系列；Scepter 2.0细胞计数器购于Millipoer公司；AxioVert A1倒置显微镜购于蔡司公司。1.1.6代谢活化系统经-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝匀浆上清液(S9)，加相应的辅助因子(6-磷酸葡萄糖、辅酶)配制成含S9组分10%的S9混合液，作为体外代谢活化系统。1.2实验方法1.2.1Ames 试验3将 5 种试验菌株分别接种于 8mL营养肉汤中，于37 培养12 h，菌液划线接种于预先制备的相应的主平板中，TA97a、TA98和TA100接种于氨苄-青霉素主平板，TA102接种于四环素主平板，TA1535接种于组氨酸-生物素主平板。37 培养48 h，待长至典型菌落后置28 冰箱保存。试验前，分别从主平板上选取相应单菌落接种于25 mL营养肉汤增菌培养，即置于37 恒温培养箱中振荡(100次/min)培养10 h，备用。根据受试物的毒性和溶解度，在加S9和不加S9代谢物活化系统条件下分别进行试验，各受试物分别设4个剂量组，同时设空白对照组、溶剂(灭菌水)对照组及阳性对照组。在加 S9条件下，TA97a、TA98 和TA100以DMSO溶解的2-氨基芴为阳性对照，浓度为10.0 g/皿；TA102以DMSO溶解的1,8-二羟蒽醌为阳性对照，浓度为50.0 g/皿；TA1535以DMSO溶解的2-氨基蒽为阳性对照，浓度为3.0 g/皿。在不加S9条件下，TA97a和TA98以50.0 g/皿的敌克松水溶液为阳性对照；TA100和TA1535以1.5 g/皿的叠氮化钠水溶液为阳性对照；TA102以4.0 g/皿的丝裂霉素C水溶液为阳性对照。用全自动Ames实验仪按技术规范的要求设置仪器参数进行试验，即2.0 mL顶层培养基、0.1 mL菌液、0.1 mL相应受试物、0.5 mL S9或0.5 mL PBS，待平皿冷凝固化后，倒置于37 生化培养箱里培养48 h，计数每皿回变菌落数。计算各菌株各剂量3个平板回变菌落数的均值和标准差。受试物诱发 TA97a、TA98、TA100、TA102 回变菌落数是溶剂对照组的2倍或2倍以上，受试物诱发TA1535 的回变菌落数是溶剂对照组的 3 倍或 3 倍以上，并出现以下情形之一，则该受试物判定为致突变阳性：呈剂量-反应关系；任何一个剂量条件检测研究癌变畸变突变0 5 9CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 1 月第 35 卷第 1 期下，出现阳性反应并有可重复性。受试物经上述5个试验菌株测定后，只要有1个试验菌株，无论在加S9或不加S9条件下为阳性，均可报告该受试物细菌回复突变试验为致突变阳性。反之为阴性。1.2.2HPRT试验4V79细胞复苏后，培养至第2代时，对细胞进行纯化处理，即将 V79 细胞置于含THMG的培养液中培