HLA-E基因表达沉默对人乳腺癌细胞生物学行为的影响_吴振村.pdf

0 1 5CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 1 月第 35 卷第 1 期收稿日期：2022-08-16；修订日期：2022-10-31基金项目：张家口市科技局重点研发计划项目资助(2021123D)作者信息：吴振村，E-mail：HLA-E基因表达沉默对人乳腺癌细胞生物学行为的影响吴振村1，周艳2(1张家口市妇幼保健院，河北张家口075000；2河北北方学院，河北张家口075000)Effect of HLA-E gene silencingon biological behavior ofbreast cancer cellsWU Zhencun1,ZHOU Yan2(1.Maternal and Child Health Care Hospital of Zhangjiakou City,Zhangjiakou 075000;2.Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei,China)【摘要】目的：探讨HLA-E基因表达对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为的影响，分析靶向HLA-E基因的小分子RNA干扰(siRNA)技术应用于乳腺癌治疗的可行性。方法：设计并合成靶向HLA-E基因的特异性siRNA序列，转染至人乳腺癌细胞MDA-MB-231，同时设立空白对照组、阴性对照组及脂质体组。实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot法分别检测各组乳腺癌细胞HLA-E mRNA及蛋白的表达；CCK-8法和流式细胞术检测各组乳腺癌细胞增殖率和凋亡率；Transwell实验检测各组乳腺癌细胞侵袭和迁移能力。结果：乳腺癌细胞转染HLA-E siRNA后，HLA-E mRNA及蛋白表达水平明显降低。与阴性对照组相比，HLA-E siRNA转染组乳腺癌细胞增殖率降低(P0.01)；凋亡率增加(P0.01)；侵袭迁移能力降低(P0.01)。结论：靶向人乳腺癌细胞HLA-E基因的siRNA能有效抑制其基因表达，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，降低乳腺癌细胞侵袭和迁移能力。【关键词】HLA-E基因；乳腺癌；小分子RNA干扰技术；基因治疗中图分类号：R73-36+2；R392.11文献标志码：A 文章编号：1004-616X(2023)01-0015-06doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.01.003【ABSTRACT】OBJECTIVE：To investigate the expression of HLA-E gene in human breast cancer cells andits effect on rates of proliferation，apoptosis，invasion and migration of breast cancer cells，and analyze thefeasibility of siRNA(small interfering RNA)silencing of HLA-E as gene therapy.METHODS：Specific siRNAsequences of HLA-E gene were designed and synthesized，and the sequences were transfected into humanbreast cancer cells MDA-MB-231 with liposome Vigofect.For comparisons，blank control，negative control andliposome groups were established.Quantitative real-time PCR and Western blot were used to detect HLA-EmRNA and protein expression.CCK-8 and flow cytometry were used to detect proliferation and apoptosis ratesofthecancercells.Transwellassaywasusedtodetecttheinvasionandmigration.RESULTS：Aftertransfection with HLA-E siRNA，gene and protein expressions of HLA-E in the cancer cells were reducedsignificantly compared with the control groups.In addition，proliferation rates of the transfected cancer cellswere significantly decreased(P0.01)，apoptosis rates were significantly increased(P0.01)while invasion andmigrationweresignificantlydecreased(P0.01).CONCLUSION：siRNAtargetingofHLA-Eeffectivelysuppressed its expression in the breast cancer cells together with inhibition of their proliferation，induction ofapoptosis，and reduction of migration and invasion.【KEY WORDS】HLA-Egene；breast cancer；small interfering RNA；gene therapy乳腺癌(breast cancer，BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，尽管早期诊断和治疗方法的进步使乳腺癌死亡率下降了38%1，但肿瘤的异质性、治疗中的耐药性、肿瘤的转移和复发，对乳腺癌的治疗提出了新的挑战2，为此临床和科研工作者也在不断尝试新的治疗方法。对乳腺癌分子基础的研究发现，癌基因和抑论著癌变畸变突变0 1 6CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.1Jan.2023癌基因等多种基因参与了乳腺癌发生发展，基因治疗成为乳腺癌治疗的一个策略3。目前采用RNA干扰技术靶向沉默特定基因在乳腺癌治疗研究中取得了较好的效果。郭智慧4和管海涛5等采用小分子RNA干扰(small interfering RNA，siRNA)技术分别沉默乳腺癌细胞DEK和survivin基因，结果均发现可显著抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。我们前期研究发现人类白细胞抗原-E(human leukocyte antigen-E，HLA-E)基因多态性可能与乳腺癌遗传易患性相关6-7；Szekely等8分析了原发性和转移性乳腺癌样本中免疫相关基因水平，发现HLA-E基因在乳腺癌转移灶表达水平较高，是潜在的治疗靶点。本研究拟采用小分子RNA技术沉默乳腺癌细胞HLA-E基因表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响，为乳腺癌的靶向治疗提供新思路。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂Vigofect转染试剂购自北京威格拉斯生物技术有限公司；DMEM 干粉购自 Gibco 公司；SuperRT cDNA Synthesis Kit 和 UltraSYBR Mixture(Low ROX)均购自北京康为世纪生物有限公司；鼠抗人 HLA-E 单克隆抗体(ab11821)购自 Abcam 公司；CCK-8试剂盒和ECL 化学发光试剂盒购自碧云天公司；Transwell侵袭小室购自美国Corning公司；1.1.2仪器化学发光成像仪购自北京原平皓生物公司；生物安全柜购自美国Thermo公司；荧光定量PCR仪购自美国伯乐公司；琼脂糖水平电泳仪购自北京六一公司；CO2培养箱购自美国Napco公司。1.1.3细胞培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231由本室保存，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37、CO2体积分数为5%的培养箱进行细胞培养和传代。1.2方法1.2.1siRNA 的 设 计从 NCBI GenBank 数 据 库中 获 取 人 HLA-E mRNA 序 列(GenBank 登 录 号：X56841.1)，利用siRNA在线设计软件DSIR(http:/biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)及RNA二级结构分析软件RNAdraw设计并筛选出与HLA-E mRNA容易结合的siRNA序列，作为HLA-E siRNA，采用随机打乱的方法设计阴性对照siRNA序列。1.2.2转染siRNA至乳腺癌细胞实验设立空白对照组(不加任何试剂)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)、脂质体组(只加 2 L 转染试剂 Vigofect)、HLA-E siRNA组(转染HLA-E siRNA)。取对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231，调整细胞浓度为4105个/mL，接种于6孔板，培养细胞至汇合度为70%80%。取HLA-E siRNA序列及阴性对照siRNA分别经转染试剂Vigofect介导转染至细胞，方法如下：5 gsiRNA 序 列 加 入 100 L 生 理 盐 水 混 匀，2 LVigofect 转染试剂加入 100 L 生理盐水混匀，将siRNA溶液逐滴加入转染试剂溶液，轻轻混匀，室温孵育15 min后逐滴加入细胞培养液中，轻轻混匀，继续培养至48 h。1.2.3实时荧光定量PCR检测HLA-E mRNA 表达水平收集转染48 h的各组细胞，TRIzol裂解法提取细胞总RNA，Eppendorf核酸定量仪检测RNA浓度和纯度，并行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。取 1 g 总 RNA，反转录合成 cDNA，实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检 测 HLA-EmRNA 表达。HLA-E上游引物5-CACGTGCCATGTGCAGCA-3，下游引物 5-CACAGCTCCAGAGACCA-3；内参GAPDH上游引物5-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3，下 游 引 物 5-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3。反 应 过 程 为：95 预 变 性 5min，95 、15 s，60、1 min 进行 40 个循环，收集荧光数据，采用2-CT法分析HLA-E mRNA的相对表达水平。1.2.4Western blot 法检测 HLA-E 蛋白表达水平收集转染48 h的各组细胞，用预冷的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按每孔80 g上样量进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，将电泳分离后蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，HLA-E单抗(12 000稀释)4 孵育过夜，PBS-T洗涤后，加入HRP-羊抗鼠二抗(15 000稀释)室温孵育2 h，PBS-T洗涤后，加入ECL底物显色。1.2.5CCK-8法检测细胞增殖抑制率转染48 h的各组细胞中加入10 L CCK-8溶液，继续培养2 h，酶标仪测定450 nm处吸光度值D(450)，按下式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=D(450)空白组-D(450)实验组/D(450)空白组100%1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡率收集转染48 h的各组细胞，调整细胞浓度为1106个/mL，细胞悬液加入Annexin V-FITC/PI(碘化丙啶)染色后，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。1.2.7Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力收集转染48 h的各组细胞，调整细胞浓度为1105个/mL，取 150 L 加入