2种广叶绣球菌多糖分子量分布及抗炎活性比较_王宏雨_.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 2 期 156 研究探讨2种广叶绣球菌多糖分子量分布及抗炎活性比较王宏雨，张迪，罗贝贝，翁梦婷，曾辉，林衍铨*1.福建省农业科学院食用菌研究所（福州 350014）；2.特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心（福州 350014）摘要以热风干燥和真空冷冻干燥2种方法制备广叶绣球菌子实体干制品,对2种干制品中可溶性多糖主要成分的分子量分布特性和体外抗炎活性进行比较分析。通过CCK-8法检测这2种可溶性多糖成分对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响,并应用脂多糖(LPS)建立小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,考察细胞上清液中NO浓度及炎症因子TNF-、IL-1、IL-6浓度等指标,比较这2种绣球菌可溶性多糖成分的抗炎活性。结果表明,热风干燥品中可溶性多糖的主要成分SCG-G的重均分子量为1.48104 Da,真空冷冻干燥品中可溶性糖的主要成分SCG-D的重均分子量为2.47105 Da。绣球菌冻干品可溶性多糖中的主要成分SCG-D对小鼠巨噬细胞增殖活性影响较小,细胞毒性低,并能显著抑制LPS诱导的NO及炎症因子TNF-、IL-1、IL-6释放的作用,存在明显剂量效应关系,表现出较好的体外抗炎活性。关键词广叶绣球菌;多糖;分子量;抗炎活性Comparison of Molecular Weight Distribution Characteristics and Anti-inflammatory Activities in vitro of Soluble Polysaccharides from Sparassis latifolia with Different Drying MethodsWANG Hongyu,ZHANG Di,LUO Beibei,WENG Mengting,ZENG Hui,LIN Yanquan*1.Institute of Edible Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences(Fuzhou 350014);2.National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding&Cultivation of Featured Edible Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences(Fuzhou 350014)Abstract There were two kinds of polysaccharide of Sparassis latifolia,one was SCG-G,which was isolated and purified from the hot air dried fruiting bodies,and the other was SCG-D,which was isolated and purified from vacuum freeze-drying dried fruiting bodies.The CCK-8 method was used to examine the effect of SCG-D and SCG-G on the proliferation of mouse peritioneal RAW264.7 macrophages in vitro under different concentrations.The production of NO,TNF-,IL-1,IL-6 were detected for inhibitory effect on LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells in vitro.The results indicated that the molecular weight of SCG-G was 1.48104 Da and the molecular weight of SCG-D was 2.47105 Da.Furthermore,SCG-D exhibit lower level cytotoxicity with lower inhibiting effect on proliferation activity.Compared with the LPS-induced model,SCG-D showed superior inhibitory effect on NO,TNF-,IL-1,IL-6 production,with dose-response relationship visibly.Keywords Sparassis latifolia;polysaccharide;molecular weight;anti-inflammatory activity*通信作者；基金项目：福建省属公益类科研院所专项（2021R1035001），福建省农业科学院科技创新团队建设专项（CXTD2021045）广叶绣球菌（Sparassis latifolia），子实体洁白细嫩，口感脆嫩爽滑，具有很高的营养保健价值。研究结果表明，绣球菌中-葡聚糖含量丰富，具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、免疫调节、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、提高机体造血功能等多种生物活性1-5。其中，抗炎活性是广叶绣球菌重要的生物学活性，Kim等6研究表明绣球菌水提物能够抑制40/80化合物诱导的小鼠全身过敏反应和血清组胺的释放，并降低PMA和A23187刺激的促炎性细胞因子的表达，在抗炎和抗过敏治疗方面具有潜在的应用价值；Choi等7对绣球菌80%甲醇提取物的研究表明该成分能够通过抑制IB的磷酸化从而降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的NO的释放水平；Han等8对绣球菌甲醇提取的氯仿萃取部分进行高效制备液相分离，获得一个高抗炎活性的成分SCF4，其能显著抑制LPS诱导的促炎介质NO、前列腺素E2及相关炎症因子TNF-、IL-6、IL-1的产生，且不表现出细胞毒性。课题组已有的研究表明，不同干燥方法得到的绣球菌子实体干制品的水溶性多糖分子量分布差异显著，烘干品水溶性多糖成分分子量分布于1030 kDa区域，而冻干品水溶性多糖成分则分布于200400 kDa区域9。试验进一步对2种不同干制方法获得的绣球菌干品的水溶性多糖的主要成分进行分离纯化，以初步纯化后的广叶绣球菌子实体烘干品可溶性多糖成分SCG-G和冻干品可溶性多糖成分SCG-D为研究对象，对其具体的HPSEC分子量分布特性进行比较，并通过检测，分析其对RAW264.7巨噬细胞增殖影响，以及对RAW264.7巨噬细胞炎症模型中NO释放量及炎 157 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 2 期症因子TNF-、IL-1、IL-6释放量等指标的影响，比较2种绣球菌可溶性多糖成分的体外抗炎活性，为绣球菌可溶性多糖抗炎生物活性的应用提供理论依据，并为相关功能成分的食品与保健品生产过程中原料干燥方式和提取方法的选择提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂绣球菌子实体鲜品（福建天益菌业有限公司）。右旋糖酐分子量标准10种（中国食品药品检定研究院）；Dextran、DXT1090K、DXT2370K右旋糖酐分子量标准（美国APSC）；CellCounting Kit-8（日本DOJINDO Laborataries）；DMSO D2650（美国SIGMA）；RPMI-1640（美国GIBCO）；FBS（美国ExCell Biology）；RAW264.7细胞、0.25%Trypsin-EDTA、小鼠TNF-、IL-1、IL-6 ELISA检测试剂盒（中国江苏凯基生物技术股份有限公司）；NO含量测定试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）；其余试剂均为国产分析纯、色谱纯；试验用水为超纯水。1.2仪器与设备超净工作台（中国苏州净化）；IX51生物倒置显微镜（日本OLYMPUS）；多功能酶标仪（美国BioTek）；xd-101 CO2培养箱（日本SANYO）；U1900紫外扫描分光光度计（日本Hitachi公司）；Waters 2695液相色谱仪（美国WATERS公司）；UM 5000蒸发光检测仪（北京通微分析仪器有限公司）；TSKgel GMPWxl色谱柱（日本东曹株式会社）；Centrifuge 5804 R离心机（德国艾本德公司）；Pilot3-6L真空冷冻干燥机（北京博医康有限公司）；Milli-Q plus超纯水器（Millipore公司）。1.3方法1.3.1绣球菌水溶性多糖成分的制备与纯化广叶绣球菌热风干燥品多糖和真空冷冻干燥品多糖的制备方法参照文献8，采用热水提取，三氯乙酸脱蛋白的方法进行。烘干品水溶性多糖组分SCG-G的纯化：将烘干品多糖用蒸馏水溶解，离心取上清定容为100 mg/mL的溶液，加入等体积的无水乙醇，混匀后静置过夜，以8 000 r/min离心10 min取上清，收集上清液减压浓缩至原体积的1/3，用截留分子量1 000的透析袋，对蒸馏水透析48 h，透析后冷冻干燥即为烘干品水溶性多糖SCG-G。冻干品水溶性多糖组分SCG-D的纯化：冻干品多糖用蒸馏水溶解后离心取上清定容为100 mg/mL的溶液，加入等体积的无水乙醇，混匀后静置过夜，以8 000 r/min离心10 min取沉淀部分，沉淀部分用蒸馏水溶解后以8 000 r/min离心10 min取上清，用截留分子量14 000的透析袋，对蒸馏水透析48 h，透析后冷冻干燥即为冻干品水溶性多糖SCG-D。1.3.2绣球菌多糖成分SCG-D、SCG-G分子量测定与多糖含量测定多糖分子量分布测定采用高效凝胶渗透色谱法，参考张迪等10试验方法并稍作调整。色谱条件：流动相采用0.05 mol/L乙酸铵，流速0.6 mL/min；柱温40；进样量20 L；色谱柱TSKgel GMPWxL（7.5 mm300 mm）。ELSD检测器：载气为空气；载气压力4.5 bar；流量2 L/min；漂移管温度60；数据分析系统Empower GPC。以重均分子量2 700，5 250，13 050，64 650，135 350，300 600，922 000和1 719 000 Da的右旋糖酐为标准品，以保留时间对分子量的对数作线性回归。多糖样品和标准品用0.05 mol/L乙酸铵溶液溶解为约2 mg/mL的浓度，用于HPSEC分析。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，多糖样品用蒸馏水配制成1 mg/mL浓度，取样100 L蒸馏水补足至1 mL后参照NY/T 16762008食用菌中粗多糖含量的测定11中的检测方法进行测定。1.3.3CCK-8法检测细胞增殖活力采用CCK-8法检测2种绣球菌多糖对RAW264.7细胞增殖活力的影响。试验方法参照文献12。将RAW264.7细胞消化、计数、配制成浓度5104个/mL的细胞悬液，于96孔细胞培养板中每孔加入100 L细胞悬液，置于37，5%CO2培养箱中培养24 h。设立阴性对照组，不同质量浓度绣球菌多糖试验组，96孔细胞培养板中每孔加入100 L相应的含药培养基，置于37，5%CO2培养箱中培养72 h。加入10 L CCK-8溶液，继续孵育3 h，摇床10 min轻轻混匀后，450 nm处检测吸光度（A）。细胞增殖活力=绣球菌多糖处理组吸光度/对照组吸光度100%（1）1.3.4细胞上清液中NO、TNF-、IL-1、IL-6浓度的检测ELISA检测方法根据试剂盒说明书和参考文献13中所述方法略作修改，将RAW264.7细胞消化、计数、配制成浓度5105 CFU/mL的细胞悬液接种到培养板中，设置空白组，LPS模型组（1 g/mL），绣球菌多糖组（多糖10 g/mL+LPS 1 g/mL，多糖50 g/mL+LPS 1 g/mL，多糖100 g/mL+LPS 1 g/mL，多糖150 g/mL+LPS 1 g/mL），置于37，5%CO2培养箱中，药