HPLC-DPPH法在线分析远志抗氧化活性成分研究_邸学.pdf

2023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1doi:10.3969/j.issn.1004-275X.2023.01.13HPLC DPPH 法在线分析远志抗氧化活性成分研究*邸学，曲浩源，王海波，裴帅龙，鲁茂盛(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600)摘要:建立了远志抗氧活性成分的在线快速分析方法，为其药效物质筛选研究提供了支持。采用 HPLC DPPH 在线分析方法，结合对照品保留值对照与活性测定，确定了活性成分，采用抗氧化阳性样品对照分析了活性成分的抗氧化活性强度。结果表明，远志中，3，6二芥子酰基蔗糖、西伯利亚远志糖酯 A6 为主要抗氧化活性成分。在线快速分析方法简捷、高效，适用于中药远志的抗氧化活性成分的快速筛选。关键词:远志;抗氧化成分筛选;HPLC DPPH中图分类号:284.1文献标识码:A文章编号:1004 275X(2023)01 0047 03apid Screening of Antioxidant Active Ingredients in Polygalae adix by HPLC DPPH*Di Xue，Qu Haoyuan，Wang Haibo，Pei Shuailong，Lu Maosheng(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)Abstract:To establise an on line antioxidant screening method for rapid detection of antioxidative components in Polygala adix for supportingpharmacodynamic studies The antioxidative actives were detected by on line HPLC DPPH method，and the bioactive ingredients were quali-tatively identified by compared with reference substance The main antioxidative active ingredients are 3，6 disinapoyl sucrose and sibricoseA6 The DPPH HPLC method is intuitive and accurate，which provides technical basis and platform support for rapid screening of antioxidantcomponents in complex natural productsKey words:polygalae radix;antioxidant screening;HPLC DPPH远志始载于 神农本草经，列为上品，来源于远志科植物远志(Polygala tenuifolia Willd)或卵叶远志(Polygala sibirica L)的干燥根，性温，味苦、辛，具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿的功效，常用于治疗心肾不交、失眠多梦、健忘惊悸等症1。远志是防治老年性痴呆方剂组合的核心药物，所含化学成分较多，有三萜皂苷类、酮类、寡糖酯类等2 3。远志可以明显增加血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低丙二醛(MDA)含量，减轻和逆转自由基的产生，加速清除、减少机体内的过氧化脂质，减少氧自由基对脑组织的氧化损伤，其抗氧化作用与药效作用密切相关4 5，传统的天然抗氧化活性产物研究，一般是通过一系列的成分分离和和纯化技术得到提取物或单体成分，再进行体内或体外活性测定，因此，研究周期长、效率低，又较为盲目，而且不利于性质不稳定化合物的抗氧化活性发现6 7。HPLC DPPH 在线筛选抗氧化成分，是将色谱柱分离后的样品溶液与 DPPH溶液混合，反应后流入检测器进行检测，抗氧化活性化合物与 DPPH 反应，使其吸收减弱从而形成倒峰;通过对比样品 HPLC 色谱图和 DPPH 自由基清除反应后 HPLC 图谱，即可进行不同成分抗氧化活性的在线分析8 9。该方法能够直观反映混合样品中不同成分清除自由基能力，实现混合样品中不同成分分离和抗氧化活性的同步测定，具有高效、原位、简捷、快速等优势，近年来已逐渐应用于天然抗氧化活性成分的筛选分析。远志的皂苷、多糖、黄酮等组分的抗氧化活性已有相关研究，但其中的糖酯类活性成分的抗氧化活性的研究报道较少。本试验研究通过 HPLC DPPH 法在线分析、全面筛选远志的抗氧化活性成分，并采用对照样品对照量化其抗氧化活性的效应，方法操作简便、高效，为远志的药效活性物质成分研究提供支持。1材料与方法1.1仪器Agilent 1100 液相色谱仪;Boltimate C18色谱柱(100 mm 4.6 mm，2.7 m);柱后反应器(0.25 mm20 m，仪佳科技有限公司);PL D2000 柱温箱(大连日普利科技仪器有限公司)。1.2材料与试剂2 联苯基 1 苦基腈基(DPPH)、6 羟基 2，5，7，8 四甲基色烷 2 羧酸(Trolox)，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(色谱纯)，购于天津市凯信化学工业有限公司;磷酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，购于天津市光复科技发展有限公司;过硫酸钾、L(+)抗坏血酸，购于国药集团化学试剂有限公司;西伯利亚远志糖酯 A6(SA6)、3，6 二芥子酰基蔗糖(DSS)，购于成都普菲德生物技术有限公司;纯净水，购于杭州娃哈哈公司。远志，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为远志科远志属植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根。742023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.12方法与结果2.1溶液的制备供试品溶液的制备:取远志药材适量，加 8 倍量水，煎煮提取 2 次，每次 2 h，合并提取液;减压浓缩至 20 mg/mL，加甲醇稀释至 10 mg/mL，微孔滤膜滤过，备用。对照样品溶液的制备:精密称取 DSS、SA6 对照品适量，分别加入甲醇配制成质量浓度为 0.1 mg/mL的对照品溶液，备用。精密称取 Trolox 对照样品，加入甲醇分别配制成质量浓度为 0.01 mg/mL 的对照样品溶液，备用。DPPH 反应液的制备:精密称取 DPPH 试剂适量，加入甲醇配制成质量浓度为 10 mol/L 的溶液，备用。2.2HPLC DPPH 法分析条件分析试验装置及流程:参考文献并优化试验装置流程，试验流路体系分别为样品高效分离路径(A)和 DPPH 自由基清除检测系统路径(B)。待测样品由路径 A 经液相色谱法分离后与 DPPH 自由基溶液经三通连接管混合，进入规格为 0.25 mm 20 m 的反应器充分反应。再经检测器检测获得样品反应后的色谱图。分别以甲醇溶液、DPPH 溶液或对照样品溶液为对照，对比分析远志成分抗氧化活性。远志成分分析:色谱柱为 Agilent C18柱(100 mm 4.6 mm，2.7 m);柱温40;流速 0.25 mL/min;进样量5 L;流动相为 0.05%磷酸水(A)0.05%磷酸乙腈(B)。梯度洗脱条件:0 5 min 8%20%(B)，10 32 min 26%32%(B)，35 42 min 55%8%(B)。检测波长为320 nm。HPLC DPPH 在线分析:为保证色谱分离效果和抗氧化活性试验结果的准确性和灵敏度，对 DPPH 反应液浓度(5、10、20 mol/L)、远志洗脱液与 DPPH溶液的体积比(2 3、1 2、1 3、1 4、1 5)、混合及反应时间(0.6、0.8、1.2 min)、反应温度(25、30、40)等多种因素影响进行优化，确定反应条件为 DPPH 反应液浓度为 10 mol/L，流速为 1 mL/min，反应器规格为 0.25 mm 20 m，反应物的质量比 1 4、反 应 时 间 0.8 min，反 应 温 度 40，检 测 波 长是 517 nm。2.3远志抗氧化活性成分在线筛选取远志供试品溶液，按 2.2 项进行远志成分及抗氧化活性效应分析，结果见图 1。远志样品抗氧化活性效应分析图上可观察到 8 个倒峰出现，其中 2、5号峰位置处倒峰强度较大，其他位置处倒峰强度较小。根据倒峰强度判断，抗氧化活性最强成分为 5 号位置成分，2 号位置成分次之，6 号等其他位置处成分抗氧化活性较弱。A.远志样品成分分析图;B.远志样品 DPPH 谱图;C.Trolox DPPH 谱图图 1HPLC DPPH 在线分析色谱图2.4远志成分抗氧化活性强度分析取对照品溶液按2.2 项进行抗氧化活性测定。保留时间对照、外标法计算远志中的 DSS(5 号)、SA6(2号)含量。再以 SA6 为对照，采用归一化法计算抗氧化活性成分近似含量。采用倒峰的峰面积与成分含量的比值，衡量抗氧化活性的强度;再以 Trolox 活性为对照，计算远志成分抗氧化活性效应比值，结果见表1。表 1远志成分抗氧化活性效应分析表峰位抗氧化活性/(A/g)活性效应比值 Trolox/%峰位成分活性/(A/g)活性效应比值 Trolox/%12.310.46210.862.132.260.4442.190.43525.904.862.140.4272.320.4682.290.45结果表明，采用对照样品对照方法进行远志成分抗氧化活性的半定量测定，量化分析不同成分的抗氧化活性的情况，发现远志药材中抗氧化活性排序为DSS、SA6。3结论与讨论本研究利用 HPLC DPPH 在线分析法，进行远志抗氧化活性成分筛选研究，能够快速实现远志中 DSS与 SA6 等抗氧化活性成分的筛选。方法简捷、高效，能够快速筛选复杂中药样品的药效活性成分。远志药材化学成分种类复杂，成分众多，对色谱分离条件要求较高。进行远志药材质量评价时，需要应用全面、准确的多成分共同测定方法，综合考虑色谱柱载样量、色谱分离效果和分析周期等多种因素，最后筛选确定分析条件。本研究表明，远志主要抗氧化活性成分 3，6 842023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1二芥子酰基蔗糖、西伯利亚远志糖酯 A6，也是远志主要药效活性组分10 12。对远志药材中各成分抗氧化活性的全面评价，有助于更准确分析远志药材多种药效成分之间的药效作用关联机制，为远志的药效物质基础研究提供研究支持。参考文献:1 国家药典委员会 中华人民共和国药典:一部 M 2020 年版 北京:中国医药科技出版社，2020:163 2 王小雨，刘传鑫，周佳丽，等 中药远志的化学成分和药理作用研究进展及其潜在质量标志物预测分析 J 国际药学研究杂志，2020，47(7):483 495 3 易东阳，闫磊，张慧，等 远志的化学成分及治疗阿尔茨海默病的药理作用研究进展J 中国药房，2014，25(11):10491051 4 杨波，朱盼，王艳，等 远志复方不同萃取部位抗氧化及安神作用的实验研究J 时珍国医国药，2013，24(12):28722873 5 张典，王园，王晓，等 远志苗水提物对 D 半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化作用 J 中华中医药杂志，2019，34(9):43224326 6 张丽君，李敏，王静，等 石榴皮中黄酮类物质的提取及抗氧化研究 J 化学工程师，2021，35(9):65 68 7 史天星，李宇光，姜勇，等 远志地上部分 10 个黄酮类成分的分离及抗氧化活性研究(英文)J 中国药学，2013，22(1):36 39 8 许平翠，张晓芹，陈礼平，等 基