ABO_BEL.11等位基...系血型血清学及分子机制研究_洪毅.pdf

161现代检验医学杂志第 38 卷第 1 期2023 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.1,Jan.2023ABO*BEL.11 等位基因突变致红细胞 B 抗原弱表达的 家系血型血清学及分子机制研究洪毅（西安高新医院输血科，西安 710075）摘要：目的探讨由 ABO*BEL.11 等位基因导致的 ABO 正反定型不符样本及家系的血清学和分子生物学特性，研究其遗传方式。方法常规血型血清学方法和吸收放散试验鉴定样本的 ABO 血型表型；PCR 方法扩增 ABO 基因 7 个外显子及其侧翼内含子，对扩增产物进行直接测序和克隆测序分析，并对先证者的亲属进行家系调查。结果先证者血型血清学结果为B弱；测序显示：存在ABO*B.01/O.01.01杂合且伴c.586C/T突变；克隆测序：c.261delG，297AG，c.526CG，c.586TC，c.657CT，c.703GA，c.796CA，c.803GC 和 c.930GA 共 9 个突变，基因型结果为 ABO*BEL.11/O.01.01。家系调查显示先证者父亲、母亲、妻子和女儿血型血清学结果分别为 B 型、O 型、A 型及 B 弱，其中先证者父亲及女儿的 ABO 基因存在 ABO*BEL.11 等位基因。结论ABO*B.01 等位基因上 c.586TC 的突变产生 ABO*BEL.11 等位基因，从而导致红细胞上 B 抗原的弱表达，且能够稳定遗传突变。关键词：ABO 血型；表型；等位基因；家系调查中图分类号：R457.1；Q786文献标识码：A文章编号:1671-7414（2023）01-161-04doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.01.030Serology and Molecular Mechanism of Family Blood Group with Weak Expression of Erythrocyte B Antigen Caused by ABO*BEL.11HONG Yi（Department of Blood Transfusion,Xian High-Tech Hospital,Xian 710075，China）Abstract:ObjectiveTo investigate the serological and molecular biological characteristics of ABO positive and negative stereotypes and lineages caused by ABO*BEL.11 alleles,and study their genetic patterns.MethodsThe ABO blood group phenotype of the samples was identified by conventional blood group serology and absorption-elution test,The seven exons and their flanking introns of the ABO gene were amplified by PCR,and the amplified products were analyzed by direct sequencing and cloning sequencing.A pedigree investigation was carried out on the relatives of the proband.ResultsThe blood group serology of the proband was Bweak.Sequencing showed that there was:ABO*B.01/O.01.01 heterozygosity with c.586C/T.Clone sequencing were c.261delG,c.297AG,c.526CG,c.586TC,c.657CT,c.703GA,c.796CA,c.803GC and c.930GA,a total of 9 mutations,and the genotype result was ABO*BEL.11/O.01.01.The pedigree investigation showed that the blood group serological results of the probands father,mother,wife and daughter were B,O,A and B weak,and the ABO*BEL.11 allele existed in the ABO gene of the probands father and daughter.ConclusionThe mutation of c.586TC on the ABO*B.01 could generate the ABO*BEL.11,resulting in weak expression of B antigen on erythrocytes.It can stabilize genetic mutation.Keywords：ABO blood group；phenotype；allele；pedigree investigation人类红细胞血型系统最重要的血型系统就是ABO 血型系统，在该系统中除 A，B，O 及 AB 常见表型外，还存在一些少见的 ABO 亚型，这些亚型有一定的遗传基础以及明确的血清学特点，主要特点为因抗原表达减弱造成 ABO 血型正反定型不符，导致血型鉴定困难引发血型错判或交叉配血不合1-2。ABO 基 因 的 位 置 在 人 类 第 9 号 染 色 体9q34.1-q34.2，长 度 约 有 19.5kb，其 中 编 码 区 有 1 062bp 长，由 7 个外显子和 6 个内含子组成，编码354 个氨基酸，其中外显子 6 和 7 对糖基转移酶的活性有着重要作用3。近年来血型基因分型技术的发展为 ABO 亚型及稀有血型的检测提供了新的方作者简介：洪毅（1975-）男，本科，副主任检验师，研究方向：输血管理、输血检验，E-mail:。向。在临床血型鉴定工作中遇到 1 例血清学血型为B 弱，基因型为 ABO*BEL.11/O.01.01 的标本，国内关于 ABO*BEL.11 导致 B 抗原弱表达的相关报道较少，本研究对此样本进行了 ABO 血型血清学检测及基因分析和家系调查，现报道如下。1材料与方法1.1研究对象男性患者，汉族，45岁，无输血史。ABO 血型常规卡式鉴定发现正反定型不符。征得患者本人和其家系成员知情同意后，采集先证者、先证者父亲、母亲、妻子及其女儿 EDTA-K2 抗凝血各 5ml。1.2仪器与试剂ABO 血型卡（瑞士达亚美有限162现代检验医学杂志第 38 卷第 1 期2023 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.1,Jan.2023公司，批号：50093.03.24）；抗A，B定型试剂、抗-A1，抗-H 及人 ABO 反定型用红细胞（上海血液生物 医药有限责任公司，批号：20201018，20201125，20200422，20210801007）；血液基因组 DNA 提取离心柱型试剂盒（Roche，德国）；Taq酶（0000328560,Promega Corporation，上海）；DL2000（AL14425A，TaKaRa Bio Inc，日本)。离心机（ID-Centrifuge 12 S，瑞士达亚美有限公司）；孵育器（ID-Incubator 37 SI瑞士达亚美有限公司）；全自动血型检测仪（型 号：IH-1000，瑞士达亚美有限公司）；台式离心机（KA-2200 型，日本久保田）；PCR 扩增仪（Sen-soquestLabcycler，德国）；水浴箱（GFL 1004，德国）；全自动血细胞洗涤离心机（MC 450，日本日立）；台式离心机（L600A,湖南湘仪离心机仪器有限公司）。试验中扩增所使用的引物3交由公司合成。1.3方法1.3.1血型血清学试验：ABO 正反定型的初次检测使用达亚美全自动血型仪进行，按文献4方法，采用试管法进行 ABO 正反定型试验的复检，同时先证者和其女儿的 ABO 血型使用吸收放散试验的方法进行确认。1.3.2DNA 制 备：使 用 德 国 Roche 血 液 基 因 组DNA 离心柱型提取试剂盒从 EDTA-K2抗凝血中提取先证者及各家系成员样本基因组 DNA。1.3.3基因分型：方法按照文献 5 方法，对先证者及各家系成员样本 ABO 基因的 7 个外显子及侧翼序列进行特异性扩增后直接测序，同时先证者及其父亲、女儿样本的外显子 6，7 进行克隆测序。引物合成和产物的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司西安测序部完成。1.3.4序列比对与分析：使用 Chromas 软件阅读分析测序图谱，与 GenBank 中 ABO 基因的参考序列（NG_006669.1）进行比较，分析确认各样本的基因型。1.3.5家系调查：先证者父亲、母亲、妻子及女儿的血液标本分别进行 ABO 血型检测及 ABO 基因的外显子测序。2结果2.1血型血清学检测结果见表 1。先证者与其女儿试管法 ABO 正定型抗-A，抗-B，抗-AB，抗-A1无凝集，与抗-H 反应强凝集，反定型 A1c 强凝集，Bc，Oc 和自身细胞均不凝集，吸收放散试验显示红细胞上存在有 B 抗原，血型血清学结果为：B 弱。先证者父亲、母亲、妻子的ABO血型正反定型相符，分别为 B 型、O 型、A 型。2.2ABO 基因测序结果与 ABO*A1.01 等位基因标准序列一一比对，先证者 ABO 基因外显子 1 5测序未发现存在突变位点，外显子 6，7 发现存在有突变位点。直接测序：ABO*B.01/O.01.01 杂合且 存在c.586C/T突变；克隆测序：c.261delG，c.297AG，c.526CG，c.586TC，c.657CT，c.703GA，c.796CA，c.803GC 和 c.930GA 共计 9 个突变位点，与ABO*B.01等位基因比对，该序列仅有c.586TC的突变，该位点的突变导致 p.C196R 的改变，基因型结果判定为 ABO*BEL.11/O.01.01。先证者父亲、母亲、妻子、女儿基因型结果分别为：ABO*B.01/BEL.11，ABO*O.01.01/O.01.02，ABO*A1.01/O.01.02和 ABO*BEL.11/O.01.02。表 1 血型血清学检测结果类 别正定型反定型吸收放散试验自身对照抗-A抗-B抗-AB抗-A1抗-HA1cBcOcBc先证者00004+4+002+s0父亲04+4+03+4+00/0母亲00004+4+4+0/0妻子4+04+4+2+w04+0/0女儿00004+4+002+0注：“w”=weak；“s”=strong；“/”=未做2.3家系调查家系调查显示先证者 c.586TC 的突变产生的 ABO*BEL.11 等位基因来自父亲一方，女儿ABO基因型中有ABO*BEL.11单倍体的存在，说明其可稳定的遗传给女儿（家系调查图谱见图1）。3讨论ABO 血型是由奥地利学者 LANDSTEINER K于 1900 年发现的。ABO 血型抗原是 ABO 基因的“第二产物”，是由糖基转移酶催化的糖生物化学合成反应的结果。ABO基因于1990年被克隆鉴定，长度约为 19.5 kb，有一个 1 062 bp 的编码区以及 7个外显子和 6 个内含子。其中外显子 6 和 7、外显子的边缘序列、增强子（CBF/NF-Y，约-3800 bp)和 ABO 的启动子（在-149 和-2 bp 之间）对糖基转移酶的催化活性至关重要，他们的变化不仅可以1