circPPP1R12A激...关节炎中软骨细胞增殖和凋亡_程建岗.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.01.003circPPP1R12A 激活 p53 信号通路调控骨关节炎中软骨细胞增殖和凋亡*程建岗1李伟华2孟国林1毕龙1成千亮3（1 空军军医大学第一附属医院骨科 陕西 西安 710032；2 空军军医大学第一附属医院综合诊疗科 陕西 西安 710032；3 通用技术西安宝石花长庆医院骨科 陕西 西安 710200）摘要 目的：探讨 circPPP1R12A（circ_0000423）调控 p53 信号通路对骨关节炎（osteoarthritis，OA）中软骨细胞增殖和凋亡的影响。方法：采用 qRT-PCR 检测 circPPP1R12A 在 OA 软骨细胞中的表达水平。在 OA 软骨细胞中分别转染 oe-circPPP1R12A 和 sh-cir-cPPP1R12A 后，采用 CCK-8 检测细胞增殖情况；免疫荧光检测 Ki-67 阳性细胞表达率；流式细胞术检测细胞凋亡情况；qRT-PCR检测 Ki-67 和 p53 表达水平；Western Blot 检测 Cleaved-caspase3、P53、BCL-2 和 BAX 的表达水平。结果：OA 软骨细胞中 cir-cPPP1R12A 的表达水平明显高于正常软骨细胞。过表达 circPPP1R12A 能够抑制 OA 软骨细胞增殖和促进细胞凋亡，通过上调p53 表达激活 p53 信号通路，低表达 circPPP1R12A 能够促进 OA 软骨细胞增殖和抑制细胞凋亡，通过下调 p53 表达阻滞 p53 信号通路。在 OA 软骨细胞中同时低表达 circPPP1R12A 和过表达 p53 能够反转单独低表达 circPPP1R12A 对 OA 软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论：circPPP1R12A 在 OA 软骨细胞中明显高表达，circPPP1R12A 能够通过激活 p53 信号通路抑制骨 OA 软骨细胞增殖和促进软骨细胞凋亡。circPPP1R12A 可能成为 OA 治疗的干预靶点。关键词：骨关节炎；circPPP1R12A；增殖；凋亡；p53 信号通路中图分类号：R684.3文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）01-14-06CircPPP1R12A Activates p53 Signaling Pathway to Regulate ChondrocyteProliferation and Apoptosis in Osteoarthritis*CHENG Jian-gang1,LI Wei-hua2,MENG Guo-lin1,BI Long1,CHENG Qian-liang3(1 Department of Orthopaedics,the First Affiliated Hospital of Air Force Military Medical University,Xian,Shaanxi,710032,China;2 Department of comprehensive diagnosis and treatment,the First Affiliated Hospital of Air Force Military Medical University,Xian,Shaanxi,710032,China;3 Department of Orthopaedics,baoshihua Changqing Hospital of general technology,Xian,Shaanxi,710200,China)ABSTRACT Objective:To investigate the effect of circPPP1R12A(circ_0000423)regulating p53 signaling pathway on chondro-cyte proliferation and apoptosis in osteoarthritis(OA).Methods:The expression level of circPPP1R12A in OA chondrocytes was detect-ed by qRT-PCR.After transfection of oe-circPPP1R12A and sh-circPPP1R12A in OA chondrocytes,CCK-8 was used to detect cell pro-liferation;immunofluorescence was used to detect the expression rate of Ki-67 positive cells;flow cytometry was used to detect cellapoptosis;qRT-PCR was used to detect the expression levels of Ki-67 and p53;Western Blot was used to detect the expression levels ofCleaved-caspase3,P53,BCL-2 and BAX.Results:The expression level of circPPP1R12A in OA chondrocytes was significantly higherthan that in normal chondrocytes.Overexpression of circPPP1R12A inhibited OA chondrocyte proliferation and promoted apoptosis,andactivated p53 signaling pathway by up-regulating p53 expression.Low expression of circPPP1R12A promoted OA chondrocyte prolifera-tion and inhibited cell apoptosis,and downregulated p53 expression to block p53 signaling pathway.Simultaneous low expression of cir-cPPP1R12A and overexpression of p53 in OA chondrocytes reversed the effects of low expression of circPPP1R12A alone on the prolif-eration and apoptosis of OA chondrocytes.Conclusions:circPPP1R12A was significantly highly expressed in OA chondrocytes,and cir-cPPP1R12A inhibited the proliferation of bone OA chondrocytes and promoted chondrocyte apoptosis by activating the p53 signalingpathway.circPPP1R12A may become an intervention target for OA treatment.Key words:Osteoarthritis;circPPP1R12A;Proliferation;Apoptosis;p53 signaling pathwayChinese Library Classification(CLC):R684.3 Document code:AArticle ID:1673-6273(2023)01-14-06*基金项目：国家重点研发计划重点专项子课题（2016YFC1100300）作者简介：程建岗，硕士，副主任医师，主要研究方向：创伤骨科，E-mail:通讯作者：成千亮（1981-），本科，主治医师，主要研究方向：创伤骨科，E-mail:（收稿日期：2022-07-10 接受日期：2022-08-07）前言骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为最常见的关节炎，严重影14现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023响着中老年人的健康和生活质量1,2。OA 的主要临床症状为关节疼痛、肿胀、僵硬、畸形和功能障碍3,4。然而，骨关节炎的发病机制尚未完全清楚。环状 RNA（circRNA）是一种新型的非编码RNA，具有共价闭环结构，没有 5-3 极性和多腺苷尾5。近期研究表明，CircRNAs 与 OA 软骨细胞增殖分化、炎症反应、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）降解、信号通路等的发生发展密切相关6,7。研究显示在 OA 中存在 136 个差异性表达CircRNAs，其中 64 个 CircRNAs 上调和 72 个 CircRNAs 下调8。最近有研究显示 circPPP1R12A（circ_0000423）在 OA 中明显高表达，并能够调控 miRNA-27b-3p/MMP-13 轴促进 OA 软骨细胞 ECM 降解9。然而 circPPP1R12A 对 OA 软骨细胞的生物学功能未完全明确。因此，本研究在 OA 软骨细胞中分别过表达和低表达 circPPP1R12A 后，探讨 circPPP1R12A 对 OA 软骨细胞增殖和凋亡的影响及机制。1 材料和方法1.1 主要试剂青霉素-链霉素溶液（100X）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、PVDF 膜、超敏 ECL 化学发光试剂盒、CCK-8 试剂盒和 Annex-in V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司。TRIZol 试剂和 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒购自日本 TaKaRa 公司。DMEM 培养基和 FBS 购自美国 Gibco公 司 lipofectamine 3000 购 自 美 国 Invitrogen 公 司。Cleaved-caspase3、P53、BCL-2、BAX 和 GAPDH 抗体购自美国abcam 公司。转染质粒购自中国上海吉凯基因有限公司。qRT-PCR 引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养与转染OA 软骨细胞和正常软骨细胞采用两步酶消化法进行分离，第 3 代用于后续实验。细胞在含 10%FBS和 1%青霉素-链霉素的 DMEM/F12 细胞培养基在 37、5%CO2平衡湿度培养箱中培养。采用 lipofectamine 3000 分别转 染oe-NC、oe-circPPP1R12A、sh-NC、sh-circPPP1R12A和sh-circPPP1R12A+p53 至 OA 软骨细胞。根据细胞转染情况不同 分 为 oe-NC 组、oe-circPPP1R12A 组、sh-NC 组、sh-cir-cPPP1R12A 组和 sh-circPPP1R12A+p53 组。1.2.2 qRT-PCR采用 Trizol 试剂提取软骨细胞中的总RNA。通过逆转录试剂盒逆转录合成 cDNA。SYBR GreenPCR 试剂盒实时荧光定量 PCR 检测 Ki-67 和 p53 表达水平。以 GAPDH 作为内参，采用 2-Ct法计算相对表达量。1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡细胞转染 48 h 后，PBS 清洗和重悬细胞，加入 Annexin-V-FITC 和 PI 在室温下避光 10min 后上机检测，ModFit LT 软件分析凋亡数据。1.2.4 Western blot收集转染 48 h 后