CADM-1对人宫颈癌He...a细胞转录组学的影响及意义_刘晔.pdf

实验与基础研究/论著CADM1 对人宫颈癌 Hela 细胞转录组学的影响及意义刘晔1，2，朱宇2，周建斌1，杜洪灵2，胡华3，蔡骁垚4，蒋漪桦21.南华大学衡阳医学院，附属第二医院，妇产科，湖南 衡阳 421001;2.上海市普陀区人民医院妇产科，上海 200060;3.南华大学衡阳医学院附属第二医院病理科;4.上海市普陀区人民医院中心实验室基金 项 目:湖 南 省 自 然 科 学 基 金 项 目 科 卫 联 合 基 金 项 目(2021JJ70112)通信作者:周建斌，Email:546612589 摘要:目的探讨粘附分子 CADM1 基因对人类宫颈癌细胞系 Hela 细胞转录组学的影响。方法构建 rLVhCADM1ZsGreenPuro 慢病毒和 rLVZsGreenPuro 对照慢病毒，将感染 rLVh CADM1ZsGreenPuro 慢病毒的 Hela 细胞作为 rLVCADM1 组，将感染 rLVZsGreenPuro 对照慢病毒的 Hela 细胞作为 rLV 组。筛选差异基因集并进行基因转录能力、基因本体(GO)功能、京都基因与基因组数据库(KEGG)信号通路、eactome 通路及疾病本体(DO)功能分析。结果rLVCADM1组CADM1相对表达量(38.572.58)显著高于 rLV 组(0.901.08)，差异有统计学意义(t=20.460，P0.05)。基因差异分析共筛选出 321 个差异表达的基因，其中表达上调 171 个、表达下调 150 个。差异最显著的前 10 个表达上调基因包括 OLFM1、TUSC3、ENSG00000285779、SPAC、CCL5、ENSG00000261512、CADM1、OAS1、CLIC3 及 CSAG3。差异最显著的前 10 个表达下调基因包括 COL16A1、SYTL4、ENSG00000278996、CGA、SLC47A1、TNC、ENSG00000276570、UGT3A1 及 MACOL。功能分析结果显示，CADM1 改变了 Hela 细胞部分基因的转录能力、参与调控 GO 功能、KEGG 信号通路、eactome 通路及 DO 功能。结论CADM1 可明显影响 Hela 细胞的转录组学。关键词:CADM1;转录组学;宫颈癌中国图书分类号:711.74文献标识码:A文章编号:1001-4411(2023)03-0516-07;doi:10.19829/j.zgfybj.issn.10014411.2023.03.034Effect and significance of CADM1 on the transcriptome ofhuman cervical cancer Hela cellsLIU Ye*，ZHU Yu，ZHOU Jianbin，DU Hongling，HU Hua，CAI Xiaoyao，JIANG Yihua*The Second Affiliated Hospital，Department of Obstetrics and Gynecology，Hengyang Medical School，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China;Department of Obstetrics and Gynecology，Putuo District Peoples Hospital of Shanghai，Shanghai，200060，ChinaAbstract:ObjectiveTo investigate the effect of CADM 1 gene on the transcriptome of human cervical cancer cell line He-la.MethodsrLVhCADM1ZsGreen Puro lentivirus and rLVZsGreen Puro control lentivirus were constructed.Hela cells infected withrLVhCADM1ZsGreen Puro lentivirus were used as rLV CADM1 group，and Hela cells infected with rLVZsGreen Puro control lentivir-us were used as rLV group.The differential gene set was screened and gene transcription ability，gene ontology(GO)function，Kyoto Geneand Genome Database(KEGG)signal pathway，eactome pathway and disease ontology(DO)function were analyzed.esultsThe rela-tive expression of CADM1 in rLVCADM1 group(38.572.58)was significantly higher than that in rLV group(0.901.08)(t=20.460，P0.05).321 differentially expressed genes were screened by gene difference analysis，including 171 upregulated genes and150 down regulated genes.The top 10 up regulated genes with the most significant differences include OLFM1，TUSC3，ENSG000000285779，SPAC，CCL5，ENSG00000261512，CADM1，OAS1，CLIC3 and CSAG3.The first 10 down regulated genes withthe most significant difference include COL16A1，SYTL4，ENSG000000278996，CGA，SLC47A1，TNC，ENSG000000276570，UGT3A1and MACOL.Functional analysis showed that CADM1 changed the transcription ability of some genes in Hela cells，participated in regu-lating GO function，KEGG signal pathway，eactome pathway and DO function.ConclusionCADM1 can significantly affect the transcrip-tome of Hela cells.Keywords:CADM1;Transcriptomics;Cervical cancer宫颈癌多发于宫颈转化区，以鳞状细胞癌最多见，约占宫颈癌病例的 80%，另一种较常见的组织学类型为腺癌，约占 10%20%。其他特殊组织学类型少见。文献1 报道，2020 年宫颈癌全球的发病约60.41 万例，死亡约 34.18 万例，目前宫颈癌是排位第 9 的常见恶性肿瘤。随着 HPV 疫苗和宫颈癌筛查的普及，宫颈癌的诊断和治疗方面均有显著进展2，但宫颈癌仍然是女性癌症死亡的主要原因之一。目前CADM1 被认为是一种新型的肿瘤抑制基因，目前认为丢失 CADM1 破坏细胞粘附是癌症生长的一种机制。CADM1 已在多个恶性中肿瘤中发现表达缺失或显著下降，如非小细胞肺癌、食道癌、皮肤黑色素瘤、肝细胞癌、卵巢癌、胰腺导管腺癌、喉鳞状细胞癌、结直肠癌、前列腺癌、神经母细胞瘤及鼻咽癌等。CADM1 在 HPV 感染的宫颈上皮内肿瘤中的表达下降程度和肿瘤的严重程度呈正相关3。CADM1615中国妇幼保健2023 年 2 月第 38 卷第 3 期Maternal and Child Health Care of China.February 2023，Vol.38，No.3在宫颈疾病发生和发展过程中的作用和机制目前尚未见报道。本研究拟探讨 CADM1 对人类宫颈癌 Hela细胞转录组学的影响，为 HPV16(+)/HPV18(+)宫颈癌的免疫诊疗提供理论依据。1对象与方法1.1研究对象宫颈癌细胞株 Hela 购自中国科学院细胞库(目录号:TCHu187)。1.2方法1.2.1慢病毒制备通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)定位 CADM1 为 NM_ 014333，委托武汉维诺赛生物技术有限公司合成 human CADM1，构建 pLVXhCADM 1 ZsGreen Puro 质粒，并完成rLVhCADM1ZsGreenPuro慢病毒和 rLVZsGreenPuro 对照慢病毒的包装。1.2.2细胞培养和感染将 Hela 细胞接种于含 10%胎牛血清(FBS)的 Dulbecco 改 良 Eagle 培 养 基(DMEM)中，在 37、5%CO2环境中培养 48 h，用 0.25%胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期的细胞，按细胞密度 3105个/ml 每孔铺板。在 37、5%CO2环境中培养 24 h，第 2 天待细胞汇合达70%80%左右，每孔按 moi=20 加入慢病毒加入60 l 滴度为 1108TU/ml 的慢病毒进行感染。本实验中将感染 rLVhCADM1ZsGreenPuro 慢病毒的 Hela 细胞作为 rLVCADM1 组，将感染 rLVZsGreenPuro 对照慢病毒的 Hela 细胞作为 rLV 组。1.2.3稳定细胞系筛选将感染了慢病毒的 rLVCADM1 组、rLV 组 Hela 细胞在 37、5%CO2环境中培养 24 h，更换新鲜的含 10%FBS 的 DMEM，2 ml/孔，在感染慢病 毒 后 的 48 h，给 每 孔 加 入0.2 l 嘌呤霉素(10 mg/ml)进行筛选。加嘌呤霉素后每隔 48 h 更换 1 次新鲜培养基，同时在荧光倒置显微镜下观察转染率，若荧光倒置显微镜下仍看到较多未转染细胞时，可再次将 0.2 l 嘌呤霉素加入每孔进行筛选，48 h 后更换 1 次新鲜培养基，筛选2 次后获得稳定过表达的 rLVCADM1 组、rLV 组Hela 细胞系。1.2.4NA 提取和逆转录聚合酶链式反应(TPC)将上述两组稳定细胞系继续培养 48 h 后，弃去培养基，加入 1 ml TIZOL 裂解液、0.2 ml 氯仿、0.5 ml 异丙醇提取总 NA，测定总 NA 浓度。根据 FastKing T Kit(With gDNase)试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司 说明书配制逆转录体系(1 l 总 NA、2 l 5gDNA Buffer、2 l 10KingT Buffer、1 l FastKing T Enzyme Mix、2 l FQTPrimer Mix，加 NaseFree dd H2O 至 20 l;)，逆转录反应条件为 42 15 min，95 3 min，4保存。通过逆转录合成互补 DNA(cDNA)，cDNA 样本20保存。采用 MyCycler PC 仪(美国 Bioad公司)和 FastFire qPC PreMix(SYB Green)试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司 进行聚合酶链反应(PC)扩增，反应体系:总体积为 20 l，含 2 FastFire qPC PreMix 10 l、正向引物 1 l、反向引物 1 l、cDNA 2 l 和 NaseFree dd H2O 6 l。反应条件:94 3 min;94 30 s，52 30 s，7230 s，40 个循环;72 10 min，12 10 s，4 保存