ERK_Smad通路在BM...髓干细胞增殖、分化中的作用_沈玉芹.pdf

亡的分子机制 J 中国老年学杂志，2019;39(15):3738-40.12Mazumder S，Plesca D，Almasan A.Caspase-3 activation is a criticaldeterminant of genotoxic stress-induced apoptosisJ Method MolBiol，2008;414:13-21.13朱宏亮，姜建伟，张建军.盐酸度洛西汀对大鼠应激性胃溃疡保护作用机制的初步探究 J 中国新药杂志，2019;28(13):1612-8.14丁新，郑勇，李静 等.长链非编码 NA XLOC009038 促进食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭 J 实用医学杂志，2019;35(3):369-74.15张向颖，李红艳，任锋，等.清肠利肝方对急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的影响 J 中西医结合肝病杂志，2019;29(2):171-3.16Mouratidis PX，Colstonk WA，Dalgeish AG.Doxycycline inducescaspase-dependent apoptosis in human pancreatic cancer cells J Int J Cancer，2007;120(4):743-52.17李雨颖，邵喜英，金莉婷，等.川楝素通过 Fas/FasL 信号通路诱导人卵巢癌细胞凋亡 J 中国中西医结合杂志，2019;39(9):1089-93.18Chen S，Yang L，Feng J，et al Nitidine chloride inhibits proliferationand induces apoptosis in ovarian cancer cells by activating the Fassignalling pathway J J Pharm Pharmacol，2018;70(6):778-86.2021-11-12 修回(编辑杜娟)EK/Smad 通路在 BMP2 介导的牙髓干细胞增殖、分化中的作用沈玉芹1崔娟娟2鲁晓娟1(1 皖西卫生职业学院附属医院口腔科，安徽六安237000;2 安徽医科大学第一附属医院口腔科)摘要 目的探讨细胞外调节蛋白激酶(EK)/SMAD 家族(Smad)通路在骨形态蛋白(BMP)-2 诱导的人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖、分化中的调节作用。方法将前磨牙 hDPSCs 分为空白组、荧光蛋白(GFP)组、BMP2 组(80 ng/ml)、BMP2+EK 通路抑制剂(U0126)组(80 ng/ml+25 mol/L);空白组正常培养不做任何处理，GFP 组转染重组腺病毒空载体溶液作为对照，BMP2 组转染 BMP2 重组腺病毒溶液，BMP2+U0126 组在 BMP2 组基础上加入 U0126 溶液进行干预培养。各组均培养7 d后，用 CCK-8 检测 hDPSCs 细胞的增殖能力;用碱性磷酸酶(ALP)染色法及茜素红染色法检测其分化能力;用实时荧光定量聚合酶链反应(T-qPC)检测 BMP2、unt 转录因子蛋白(unx)2、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨唾液蛋白(BSP)基因表达;用蛋白 Western 印迹法检测各组细胞中 EK1/2 及其磷酸化(p)-EK1/2、Smad1/5/8 及其磷酸化蛋白(p-Smad1/5/8)、unx2、DSPP、BSP 蛋白表达水平。结果hDPSCs 分离培养的第3 代 hDPSCs 呈长梭形且阳性表达 CD29、CD44 及波形蛋白，阴性表达CD34 及角蛋白。与空白组比较，BMP2 组细胞 ALP 染色区域所占百分比、矿化结节能力和 BMP2、unx2、DSPP、BSP mNA 表达水平及 p-EK1/2/EK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、unx2、DSPP、BSP 蛋白表达水平均明显升高(P0.05);与 BMP2 组比较，BMP2+U0126 组除 BMP2 mNA 表达差异无统计学意义(P0.05)外，其余上述指标均明显降低(P0.05);GFP 组和空白组相比上述指标差异无统计学意义(P0.05)。结论EK/Smad 通路在 BMP2 介导的 hDPSCs 细胞增殖、分化作用中处于激活活化状态，发挥重要作用。关键词 人牙髓干细胞;骨形态蛋白 2;细胞外调节蛋白激酶/SMAD 家族通路;细胞增殖;细胞分化中图分类号 329.3 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0688-06;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.046基 金 项 目:吴 阶 平 医 学 基 金 会 临 床 科 研 专 项 基 金 项 目(320.6750.18418)通信作者:崔娟娟(1982-)，女，博士，副主任医师，主要从事牙体牙髓病学的临床诊治和基础研究。第一作者:沈玉芹(1974-)，女，副主任医师，主要从事牙体牙髓病学的临床诊治和基础研究。牙髓干细胞(DPSCs)是存在于牙髓中的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，是牙本质再生的重要种子细胞1。近年来，以 DPSCs 作为种子细胞实现牙髓牙本质再生修复的研究受到国内外学者的广泛关注1。骨形成蛋白(BMP)2 可诱导和调控 DPSCs向成牙本质细胞分化2，研究证实，BMP2 可通过激活细胞信号转导分子 SMAD 家族成员 1/5/8(Smad1/5/8)途径，促进 DPSCs 中的 Smad1-unt 相关转录因子蛋白(unx)2 和 unx2-牙本质涎磷蛋白(DSPP)相互作用，调控 DPSCs 分化3，4。近来研究发现，细胞外调节蛋白激酶(EK)通路也参与调控 DPSCs 成骨、成牙分化过程5，6，且已有研究发现 EK 通路阻滞剂能够抑制 unx2 的活化7，并阻断 Smad1/5/8和 EK1/2 信号在 unx2 的会聚，调控 DPSCs 的牙母质分化8。但 BMP2 与 EK/Smad 通路之间的调控机制还不甚明确。给予 EK1/2 抑制剂能否完全逆转 BMP2 促进干细胞成骨分化作用还未见报道。本研究对此进行探究验证，以期阐明 BMP2 在 DPSCs 牙髓牙本质再生修复过程中的其他可能的调控机制。1材料与方法1.1主要材料人前磨牙牙髓干细胞(hDPSCs)886中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷(货号:HZNC024，购自上海沪震实业有限公司);胎牛血清 DMEM 培养基和兔抗人 CD44、CD34、CD29、骨唾液蛋白(BSP)多克隆抗体和小鼠抗人 GAPDH单克隆抗体(货号:E510002、E600010、D261338、D263155、D261488、D190090 上海生工生物工程股份有限公司);EK 通路抑制剂 U0126(上海碧云天生物科技有限公司，货号:S1901)，兔抗人 EK1/2、磷酸 化(p)EK1/2、DSPP、unx2 抗 体(货 号:ab17942、ab223500、ab272929、ab236639，均购自美国 Abcam 公司);Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 抗体(货号:10822-100，10823-1001，购自艾美捷科技有限公司);碱性磷酸酶(ALP)染液及活性测定试剂盒(货号:D001、A059，购自南京建成生物工程研究所)，茜素红、逆转录试剂盒(货号:G8550、T2210，均购自北京索莱宝生物科技有限公司)。重组腺病毒(Ad-GFP)、携带 BMP2 基因的腺病毒载体(Ad-BMP2)均由美国芝加哥大学医学中心何通川教授团队构建并馈赠。1.2hDPSCs 培养、鉴定取液氮中冻存的 hDPSCs细胞，常规复苏后，以胎牛血清 DMEM 培养基吹成混悬液;转入 6 孔板中，在 5%CO2、37条件下常规培养;2 d 后半量换液，收集上清液，加入 DMEM 培养基进行常规培养，待细胞生长至 85%融合度时，加入 0.25%胰蛋白酶消化传代，收集生长良好的第3 代 hDPSCs，调整细胞浓度为 105个/ml 后，以每孔200 l 接种至 6 孔细胞板上。常规培养过夜后，弃上清液，经磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，用 4%多聚甲醛固定 20 min、0.5%Txion X-100 处理 20 min、3%H2O2处理 15 min，反复漂洗后，以山羊血清封闭10 min;加入稀释一抗(CD29、CD34、CD44、波形蛋白、角蛋白抗体，稀释倍数为 1 200)，于 4下孵育过夜，并将加入等量的 PBS 作为阴性对照;次日，加入二抗(生物素标记)于 37下孵育 20 min;经链霉卵白素(辣根酶标记)孵育 20 min，二氨基联苯胺(DAB)显色液显色 10 min 后，树胶封片，显微镜下观察拍照。1.3hDPSCs 分组与处理取生长良好的第 3 代hDPSCs 细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化后，用含 10%胎牛血清 DMEM 培养基配制成密度为 5104个/ml的细胞悬液，接种于 48 孔板上，并分为空白组、荧光蛋白(GFP)组、BMP29组、BMP2+EK 通路抑制剂(U0126)6组，每组设置 6 个复孔。于 37、5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁培养 6 h 后，空白组不做任何处理并进行正常培养;GFP 组加入终浓度为 80 ng/ml 的重组腺病毒(Ad-GFP)溶液及终浓度为 8 mg/L 的聚凝胺以增强病毒转染;BMP2 组加入终浓度为 80 ng/ml 的携带 BMP2 基因的腺病毒载体(Ad-BMP2)溶液及终浓度为 8 mg/L 的聚凝胺的溶液进行转染;BMP2+U0126 组在 BMP2 组基础上加入终浓度为25 mol/L 的 U0126 溶液。各组细胞处理后置于 37，5%CO2孵箱中培养 8 h 后更换新鲜培养基，并分别于转染后 48 h 观察荧光表达情况，并用 T-qPC 法检测细胞中 BMP2 mNA 表达情况，以判定 BMP2 基因转染效果。1.4CCK-8 法检测各组细胞增殖情况取生长良好的第 3 代 hDPSCs 细胞，按 1.3 方法分组处理后，分别取转染后培养 1、3、5 d 的各组细胞，加入10 lCCK-8，于 37 条件下孵育 4 h 后用酶标仪检测562 nm波长下的吸光值，绘制细胞生长曲线。1.5ALP 染色检测 ALP 活性收集处理7 d 后的各组细胞，用4%多聚甲醛固定 20 min，加入 ALP 染色30 min 后洗去染色液后，置于显微镜下观察拍照，并采用 Image pro-plus 软件测定染色区域所占百分比，染色区域所占百分比=(染色面积/总面积)100%。1.6茜素红染色将长势良好的第 3 代 hDPSCs按照每孔 106个细胞接种至 6 孔板上，按照 1.3 方法分组处理 21 d 后，弃培养液;经 4%多聚甲醛固定、磷酸缓冲液洗涤后，加入 1%茜素红溶液染色15 min，洗去染色液后，显微镜观察拍照。1.7T-qPC 检测收集处理 7 d 各组细胞，利用Trizol 试剂盒提取总 NA，取 1 g NA 逆转录合成单链 cDNA 后，将 cDNA 作为模板行实时荧光定量PC 反应，2Ct法计算 hDPSCs 中 BMP-2、unx2、DSPP 和 BSP mNA 表达水平，GAPDH 作内参照。其中，反应条件如下:95 120 s(1 个循环)，9530 s、55 60 30 s、72 30 s(40 个循环)，72300 s(1 个循环);由大连宝生物公司合成的 T-qPC 扩增引物序列如下:BMP2 上游引物 5-TCT-TCTCCAATGACCGCAGCAATG-3、下游 5-CTCCTC-CTCTTGGCTCTCACCTG-3;unx2 上 游 引 物 5-CCAACCCACGAATGCACTATC-3、下 游 5-TAGT-GAGTGGTGGCGGACATAC-3;DSPP 上 游 引 物 5-TTCCGATGGGAGTCCTAGTG-3、下 游 5-