ANGPT2单克隆抗体对A...生和下游信号蛋白表达的影响_苗玉迪.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1论著ANGPT2单克隆抗体对AML小鼠肿瘤组织血管增生和下游信号蛋白表达的影响苗玉迪1，胡星星1，李艳春21陕西省人民医院血液内科，陕西 西安710068；2西安国际医学中心医院血液病医院实验诊断中心，陕西 西安710018通讯作者：李艳春，Email：【摘要】目的探讨ANGPT2单克隆抗体对急性髓系白血病（AML）小鼠肿瘤组织血管增生、下游信号蛋白表达的影响。方法建立AML 小鼠模型20只，对照组与实验组各10只，采用免疫组织化学方法检测微血管密度及 VEGF 表达情况，采用 Western blot 检测下游信号通路蛋白 TIE2、SHP2 和 PI3K 的表达水平。结果ANGPT2 单克隆抗体治疗后，AML 小鼠肿瘤组织微血管密度及 VEGF 表达水平显著下降 79.29%（P0.01），下游信号通路蛋白 SHP2 蛋白表达水平上升 59.43%，PI3K 蛋白表达水平下降 20.37%（P0.01）。结论ANGPT2单克隆抗体显著抑制AML小鼠肿瘤组织血管增生。【关键词】急性髓系白血病；促血管生成素2；单克隆抗体；血管增生；型酪氨酸激酶受体2基金项目：陕西省自然科学基础研究计划（2021JM548）DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.11Effects of monoclonal antibody ANGPT2 on vascular hyperplasia and downstream signaling protein expression in tumor tissues of AML miceMIAO Yudi1，HU Xingxing1，LI Yanchun21Department of Hematology，Shaanxi Provincial Peoples Hospital，Xian，Shaanxi Province 710068，China；2Experimental Diagnosis Center of Hematology Hospital of Xian International Medical Center Hospital，Xian，Shaanxi Province 710018，ChinaCorresponding author：LI Yanchun，Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of monoclonal antibody ANGPT2 on vascular proliferationand downstream signaling protein expression in tumor tissues of AML mice.MethodsAfter establishing the AMLmouse model，immunohistochemistry was used to detect the microvascular density and VEGF expression，and Western blot was used to detect the expression levels of downstream signaling pathway proteins TIE2，SHP2 and PI3K.ResultsAfter treatment with ANGPT2 monoclonal antibody，the microvascular density and VEGF expression levelin tumor tissues of AML mice were significantly decreased，and the expression level of SHP2 protein in downstreamsignaling pathway was increased，while PI3K protein expression level was decreased.ConclusionANGPT2 monoclonal antibody can significantly inhibit angiogenesis in tumor tissues of AML mice，suggesting its potential application in the clinical treatment of AML in the future，and providing a theoretical basis for targeted therapy of AML.【Key words】Acute myelogenous leukemia；Angiopoietin（ANGPT）2；Monoclonal antibody；Vascularhyperplasia；Type tyrosine kinase receptor 2（TIE2）急 性 髓 系 白 血 病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种髓系干细胞前体恶性肿瘤，由于血细胞前体的基因改变导致肿瘤克隆骨髓干细胞的过量产生，导致造血干细胞的紊乱。AML 发病率居高不下，并且在确诊的白血病患者中占据相当高的比例，严重危害人类健康1。血管新生在实体瘤和恶性血液系统肿瘤中起着重要的作用，其中促血管生成素（Angiopoietin，ANGPT）发挥关键的调节作用。促血管生成素家族包括 ANGPT1、ANGPT2、ANGPT3 和 ANGPT4 共 4 个成员，它们具有相同的受体，即型酪氨酸激酶受体 2（Typetyrosine kinase receptor 2，TIE2）23。ANGPT2 主要由内皮细胞分泌，ANGPT2TIE2 信号通路在肿瘤血管生成过程中作用匪浅，主要通过拮抗63解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1ANGPT1 调控内皮细胞生成、存活和血管结构稳定4。有研究表明，ANGPT2通过外显体诱导人肝癌血管生成，是抗血管生成治疗的潜在的靶点5，同时在血液系统肿瘤中高表达且与 AML 的预后密切相关6。深入了解ANGPT2单克隆抗体对AML小鼠肿瘤组织血管增生、下游信号蛋白表达的影响，不仅可以探究ANGPT2单克隆抗体对急性髓系白血病发生发展及对下游信号通路蛋白的影响，还可为AML 的缓解与治疗提供突破点。本研究拟建立AML 小鼠模型，在动物水平上探究 ANGPT2 单克隆抗体对AML 小鼠肿瘤组织血管增生、下游信号蛋白表达的影响，阐明 ANGPT2 单克隆抗体通过调控下游信号通路影响AML 进展的分子机制，为未来AML的靶向治疗提供理论基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物与细胞株NOD/SCID小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，共 20 只；HL60 髓细胞白血病细胞购买自中国科学院上海细胞库。1.1.2主要试剂与仪器ANGPT2 单克隆抗体（Epitomics 公司），CD34、VEGF、TIE2、SHP2、PI3K、GAPDH 抗体（CST 公司），IMDM 培养基、胎牛血清和青链霉素双抗（美国Hyclone公司），DMSO（美国Sigma公司），等。1.2方法1.2.1HL60细胞培养HL60髓细胞白血病细胞置于含 10%的胎牛血清、100 U/mL 青链霉素双抗的RPMI1640培养基中培养，培养条件为37、5%CO2的湿化空气，定时更换培养基，取对数期细胞用以后续实验。1.2.2AML小鼠模型的建立取对数期 HL60 细胞，按照1107细胞数量在无菌条件下于左下腹腹腔注射接种于每只 NOD/SCID 小鼠。小鼠饲养环境为自然采光，室内通风情况良好，室温保持2024，湿度为40%60%，明暗周期12 h。接种后持续观察小鼠状态，包括精神状况、食欲、活动情况、肿瘤大小、生存时间等。1.2.3ANGPT2单克隆抗体处理取 20 只成功建立的 AML 小鼠模型，随机平均分为 2 组。对照组小鼠每只左下腹腹腔注射生理盐水 0.1 mL；观察组小鼠每只左下腹腹腔注射ANGPT2单克隆抗体30 g。所有小鼠每周注射 2 次，持续 3 周。小鼠脱颈法处死后，无菌操作下取小鼠的肿瘤组织，一部分液氮冷冻用于 Western blot 检测；一部分用4%多聚甲醛处理以固定。1.2.4免疫组织化学法检测肿瘤组织血管增生情况取小鼠肿瘤组织制作石蜡切片，采用免疫组织化学方法对肿瘤组织进行肿瘤微血管密度（MVD）检测，同时检测血管内皮生长因子（VEGF）表达情况。1.2.5Western blot 检测肿瘤组织中 TIE2、SHP2、PI3K 蛋白表达情况采用 RIPA 裂解液提取小鼠肿瘤组织蛋白，Western blot 方法检测肿瘤组织中ANGPT2 下游通路蛋白 TIE2、SHP2、PI3K 的表达情况，采用GAPDH作为内参。1.2.6观察指标（1）免疫组织化学法检测肿瘤组织血管增生情况：肿瘤微血管密度及 VEGF 表达情况测定采用CD34标记内皮细胞，细胞质棕色染色即阳性表达，采用 200 倍镜统计 5 个视野中微血管数量，阳性表达细胞数目10%为高表达，10%为低表达。（2）Western blot 检测肿瘤组织中 TIE2、SHP2、PI3K 蛋白表达情况：采用 ImageJ 软件对目的蛋白和内参蛋白的灰度比值进行计算。1.3统计学分析在每个实验中，每个样本设置3个平行，并且重复3次相同的实验；所有数据均用均数标准差（MeanSD）来表示，数据的比较采用 SPSS 21.0 进行分析，P0.05为差异有统计学意义，所有检验均为双侧检验。2结果2.1ANGPT2 单克隆抗体对 AML 小鼠肿瘤组织血管增生影响与对照组比较，ANGPT2单克隆抗体处理后小鼠肿瘤组织中微血管密度及 VEGF 表达降低79.29%（P0.01）（表1），提示其能抑制肿瘤组织血管增生。2.2ANGPT2 单克隆抗体对 AML 小鼠肿瘤组织TIE2、SHP2、PI3K蛋白表达的影响Western blot 结果显示，ANGPT2 单克隆抗体处理后，对照组与实验组小鼠肿瘤组织中TIE2表达均为阴性；与对照组相比，实验组小鼠肿瘤组织64解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1MVD/200视野（MeanSD）VEGF低表达（n）VEGF高表达（n）对照组3152198521ANGPT2抗体实验组15.493.82*17*4*表1肿瘤组织免疫组化检测结果注：与对照组比较，*P0.01中 TIE2 表达为阴性，SHP2 蛋白表达水平上升59.43%，PI3K 蛋白表达水平下降 20.37%，差异有统计学意义（P0.01，图1）。3讨论AML是一种发病率与死亡率居高不下的白血病，严重危害人类健康7。临床普遍采用化疗及干细胞移植等治疗方法，但同时伴随有不良反应大、治疗周期长等缺点89。高效安全的抗体靶向治疗有望成为未来 AML 治疗的新选择。恶性肿瘤的血管生成在肿瘤生长和转移过程中至关重要。ANGPT2 能够通过与 TIE2 结合以拮抗 ANGPT1，从而达到使血管通透性增加而稳定性改变的作用1012。血管内皮细胞中ANGPTL2的存在将会加速白血病进展13。在AML小鼠模型基础上，有研究采用腹腔注射丙戊酸以抑制 AML 细胞扩散时，发现肿瘤 MVD 降低的同时 ANGPT1、ANGPT2以及 VEGF 的表达水平均显著下降14。基于ANGPT2 抗体的免疫疗法有望改善急性髓系白血病的疗效并降低化疗药物的毒性1516，以减轻患者痛苦，达到更好的治疗效果。因此，由于 ANGPT2抗体在 AML 治疗的潜在应用价值，探讨 ANGPT2抗体对AML 小鼠肿瘤组织血管增生的作用，将为AML的临床治疗提供实验