养禽与禽病防治2022年第8期ALV-J/K双重荧光定量PCR检测方法的建立郭妍妍1，董欣怡1，黄健意2，李锦群1，廖明1，曹伟胜1*（1.华南农业大学兽医学院，人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，农业部兽用疫苗创制重点实验室，广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广州510642；2.广西忻城县畜牧站，广西忻城546200）摘要：为建立可同时检测临床上主要流行的J、K亚群禽白血病病毒（AvianleukosisvirussubgroupJ/K,ALV-J/K），选取ALV-J（CHN06）pol基因3′端和gp85编码基因之间的保守区域及ALV-K（GDFX0601）gp85编码基因保守区域设计引物和TaqMan探针，经过优化反应条件，建立了可同时检测ALV-J和ALV-K的双重荧光定量PCR方法，并通过特异性实验、灵敏性实验和稳定性实验对该方法进行评估。结果显示，该方法仅能特异性扩增ALV-J和ALV-K，与A、B、E亚群ALV及其他常见禽类病毒等均无交叉反应；其最低检测限度为3.16×101copies/μL，比普通PCR灵敏性高100倍；其批内与批间变异系数均小于2％；将101份血浆样品接种DF-1细胞，并分别通过ALV-J/K双重荧光定量PCR、ALVp27ELISA和普通PCR检测，结果显示，3种检测方法的总阳性率分别为17.8％（18/101）、10.9％（11/101）和10.9％（11/101）。以上结果表明，该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，可为ALV-J和ALV-K的诊断提供技术支持。关键词：ALV-JALV-K双重荧光定量PCR禽白血病（Avianleukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avianleukosisvirus，ALV）引起、以禽类多器官肿瘤为主要特征的禽类传染病[1,2]。AL作为我国优先防控的二类动物疫病，也是种禽场重点监测和净化的种源性疫病，对养禽业危害巨大。目前ALV分为A～K共11个亚群，其中ALV-J感染鸡可引起髓细胞性白血病，致病性强，而多数ALV-K复制能力和致病性弱，易于逃脱常规检测[3,4]。ALV-J和ALV-K是近年来我国鸡群中流行的主要亚群，且临床上存在ALV多亚群共感染的特点[5-7]。目前仍无有效疫苗和药物用于AL防控，通过检测并及时淘汰阳性鸡是净化的有效措施，故灵敏有效的检测技术对ALV净化十分必要。目前常用的检测方法主要包括病毒分离[8]、ELISA方法[9]、间接免疫荧光试验[10]、环介导等温扩增技术[11]以及常规[12]和实时定量PCR等[13]，这些方法均具有一定的局限性。其中荧光定量PCR方法具有特异性高、灵敏性强等优点，目前已有检测常见外源性ALV各亚群的单一qPCR方法，但尚无针对ALV-J基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2020B020...
