ALV-J_K双重荧光定量PCR检测方法的建立_郭妍妍.pdf

养禽与禽病防治2022 年第 8 期ALV-J/K 双重荧光定量PCR 检测方法的建立郭妍妍1，董欣怡1，黄健意2，李锦群1，廖明1，曹伟胜1*（1.华南农业大学兽医学院，人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，农业部兽用疫苗创制重点实验室，广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广州510642；2.广西忻城县畜牧站，广西忻城546200）摘要：为建立可同时检测临床上主要流行的 J、K 亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virussubgroup J/K,ALV-J/K），选取 ALV-J（CHN06）pol 基因 3端和 gp85 编码基因之间的保守区域及 ALV-K（GDFX0601）gp85 编码基因保守区域设计引物和 TaqMan 探针，经过优化反应条件，建立了可同时检测 ALV-J和 ALV-K 的双重荧光定量 PCR 方法，并通过特异性实验、灵敏性实验和稳定性实验对该方法进行评估。结果显示，该方法仅能特异性扩增 ALV-J和 ALV-K，与 A、B、E 亚群 ALV 及其他常见禽类病毒等均无交叉反应；其最低检测限度为 3.16101copies/L，比普通 PCR 灵敏性高 100 倍；其批内与批间变异系数均小于 2；将 101 份血浆样品接种 DF-1细胞，并分别通过 ALV-J/K 双重荧光定量 PCR、ALV p27 ELISA 和普通 PCR 检测，结果显示，3种检测方法的总阳性率分别为 17.8（18/101）、10.9（11/101）和 10.9（11/101）。以上结果表明，该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，可为 ALV-J和 ALV-K 的诊断提供技术支持。关键词：ALV-JALV-K双重荧光定量 PCR禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起、以禽类多器官肿瘤为主要特征的禽类传染病1,2。AL作为我国优先防控的二类动物疫病，也是种禽场重点监测和净化的种源性疫病，对养禽业危害巨大。目前 ALV分为 AK共 11 个亚群，其中ALV-J 感染鸡可引起髓细胞性白血病，致病性强，而多数 ALV-K 复制能力和致病性弱，易于逃脱常规检测3,4。ALV-J 和 ALV-K是近年来我国鸡群中流行的主要亚群，且临床上存在 ALV多亚群共感染的特点5-7。目前仍无有效疫苗和药物用于 AL防控，通过检测并及时淘汰阳性鸡是净化的有效措施，故灵敏有效的检测技术对 ALV净化十分必要。目前常用的检测方法主要包括病毒分离8、ELISA方法9、间接免疫荧光试验10、环介导等温扩增技术11以及常规12和实时定量 PCR 等13，这些方法均具有一定的局限性。其中荧光定量 PCR 方法具有特异性高、灵敏性强等优点，目前已有检测常见外源性 ALV各亚群的单一 qPCR 方法，但尚无针对 ALV-J基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2020B020222001）、广东省家禽产业技术体系（2022KJ128）、国家肉鸡产业技术体系（CARS-41-G16）作者简介：郭妍妍（1996-），女，安徽安庆人，硕士，主要从事动物传染病方向研究，E-mail:*通讯作者：曹伟胜，教授，主要从事家禽重要传染病的预防、控制和净化，E-mail:中图分类号：S855.3 文献标志码：A 文章编号：1008-3847（2022）08-0002-072-养禽与禽病防治2022 年第 8 期引物/探针序列（53）长度（bp）K-FGAGCATTGACAHGCTTTCAGAT193K-RGWAGCGAGAACCTGTCTGTGK-P（FAM）CTCCTCCTCCGCCGCAAYTACACAGA（BHQ1）J-FCTAAGAAAGATGAGGCGAGCC193J-RCAACRGAAATAATAACCACGCACJ-P（HEX）TTCTGACTGGGCACCCTGGAAAGGT（BHQ1）和 ALV-K的双重检测方法的报道14-16，而多重qPCR 方法相比于单一 qPCR 方法可以有效节省时间、试剂和耗材等，大大提高了检测效、率17。因此本研究基于 ALV-J 和 ALV-K的特异性保守区域设计了引物和探针，成功建立了ALV-J/K双重荧光定量 PCR 方法，该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，可为 ALV-J和 ALV-K的诊断提供技术支持。1材料1.1毒株ALV-A 分离株（GD13-1）、ALV-B 分离株（CD08）、ALV-J 分离株（CHN06）、ALV-E 分离株（HN1301）、ALV-K 分离株（GDFX0601）、马立克氏病病毒（Marek s disease virus,MDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、禽腺病毒（Fowl adenovirus,FADV）和禽网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）均由本实验室保存。1.2主要试剂SQ Tissue DNA 提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、质粒小量提取试 剂盒均为美国OMEGA公司产品；总 RNA提取试剂盒为上海飞捷生物技术有限公司产品；E.coli DH5 感受态细胞由天根生物科技有限公司提供；Ex-Taq 酶、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂、反转录酶 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser、DEPC水和 TA 克隆载体 pMD19-T等均由宝生物工程（大连）有限公司提供；禽白血病ELISAp27 抗原检测试剂盒为美国 IDEXX公司产品。2方法2.1引物和探针设计从 GenBank 获取不同亚群 ALV 基因组序列，通过 DNASTAR 7.1 软件中 MegAlign 程序进行多序列比对，选取 ALV-J 和 ALV-K 的特异性保守区域利用 Primer 5 软件设计探针和引物，探针和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表 1引物和探针序列2.2重组质粒标准品的制备按照上海飞捷公司 RNA 抽提试剂盒操作要求，提取 CHN06（ALV-J）和 GDFX0601（ALV-K）RNA，使用 PrimeScriptTMRTreagent Kit将 RNA反转录为 cDNA。进一步通过表 1 中的引物进行 PCR 扩增，PCR 产物经回收纯化后连接至 pMD19-T载体，转化至 DH5 感受态细胞，随后进行平板克隆、菌液测序。对测序正确的菌液进行扩繁，并提取标准质粒，提取好的质粒进行浓度测定。将 2 个测定好浓度的重组质粒标准品均稀释至 100 ng/L，计算拷贝数为3.161010copies/L。2.3双重荧光定量 PCR 反应条件的优化采用 20 L总反应体系，将 2 种质粒标准品等体积等浓度涡旋混合，10 倍梯度稀释至3.16100copies/uL，以 105copies/L 的标准混合质粒为模板，通过 Premix Ex TaqTM(ProbeqPCR)试剂进行双重荧光定量 PCR 反应，分别对退火温度（53.0、53.5、54.3、55.4、56.6、57.8、59.0、60.1、61.0、61.7和62.0）、引物终浓度（0.1 M、0.2 M、0.3M、0.4 M 和 0.5 M）、探针终浓度（0.23-养禽与禽病防治2022 年第 8 期M、0.3 M、0.4 M、0.5 M 和 0.6 M）进行反应条件的优化，以出现最高荧光值及最低CT值的条件为最佳荧光定量反应条件。2.4标准曲线的建立采用优化好的反应体系及扩增条件，将阳性质粒标准品 10 倍梯度连续稀释，以 108copies/L101copies/L 的标准混合质粒为模板，进行双重实时荧光定量 PCR 扩增，由软件生成以模板拷贝数为横坐标，以 CT 值为纵坐标的标准曲线，得到相关系数 R2 及扩增效率 E 值。每个稀释度设置 4 个重复，并设置阴性对照。2.5特异性实验分别以 REV、AIV、ALV-A、ALV-B、ALV-E的 cDNA以及 MDV和 FADV基因组 DNA为模板，使用本研究建立的方法进行扩增，同时设置阴阳对照，以评估该方法的特异性。2.6灵敏性实验将阳性质粒标准品 10 倍倍比稀释，选取1010copies/L100copies/L的标准混合质粒为模板，同时设置去离子水为阴性对照，进行qPCR 扩增，以确定该方法的最低检测限度。2.7稳定性实验将阳性质粒标准品 10 倍倍比稀释，选取106copies/L、105copies/L 和 104copies/L的混合标准质粒为模板，每个稀释度 3 个重复，在相同的条件下，用优化好的反应条件进行qPCR 扩增，计算批内变异系数，以评估批内稳定性。同时每间隔 1 周进行 1 次 qPCR 反应，连续检测 3 次，计算批间变异系数，进行批间稳定性评估。2.8临床样品检测无菌操作随机采集广东某正在进行外源性ALV 净化的种禽场核心群抗凝血样品共 101份，分离血浆接种 DF-1 细胞，维持培养 9 d 后，通过 p27 抗原 ELISA 试剂盒检测细胞培养上清，同时提取培养细胞 RNA，反转录成 cDNA，分别用建立的双重荧光定量 PCR 方法和普通PCR 方法进行检测，比较 3 种方法的符合度。其中，普通 PCR 所用引物为 K1/K213（53：TCCAGGCCGCAACTCAC，CATACCACCACC-CACGTACT）和 H5/H718（53：GGAT-GAGGTGACTAAGAAAG，CGAACCAAAGGTAACACACG）。3结果与分析3.1重组质粒标准品的制备分别以 ALV-J-HN06、ALV-K-GDFX0601的 cDNA为模板，利用表 1 中引物进行 PCR 扩增，扩增产物大小均为 193 bp，将扩增产物回收纯化并连接至 pMD19-T克隆载体，将重组质粒标准品分别命名为 pMD-HN06、pMD-GDFX0601。3.2双重荧光定量 PCR 反应条件的优化在预设的退火温度梯度中（53.062.0），选择最佳退火温度 57.8，ALV-J 上下游引物终浓度为 0.2 M，ALV-K 上下游引物终浓度为 0.3 M，2 者探针终浓度均为 0.1 M，扩增体系为 20 L。qPCR 扩增程序为：95预变性30 s，95变性 5 s，57.8退火 30 s，并收集荧光信号，40 个循环。3.3标准曲线的构建以 108copies/L101copies/L的标准混合质粒为模板，通过优化好的扩增体系和条件，根据不同拷贝数质粒所对应的 CT 值，建立相应的标准曲线（图 1）。其中 ALV-J 满足的标准曲线方程为 y=-3.4x+37.12，R2=1.00，扩增效率E=97；ALV-K 满足的标准曲线方程为 y=-3.3x+38.02，R2=0.99，扩增效率 E=100，两者均具有良好的线性关系。3.4特异性结果分 别 以 ALV-A、ALV-B、ALV-E、MDV、REV、FADV、AIV 的 cDNA 或 DNA 为模板，以105copies/L的标准质粒为阳性对照，以去离子水为阴性对照，进行特异性实验，结果显示仅加入标准质粒的孔出现特异性扩增，阴性对照和其他模板组未出现特异性扩增曲线或 CT值35，判定为阴性（图 2）。3.5灵敏性结果以 1010copies/L100copies/L 的标准混质粒为模板进行灵敏性实验，结果显示，在CT 值35 时，建立的双重荧光定量方法对ALV-J 和 ALV-K 阳性标准品的检测下限均为-4-养禽与禽病防治2022 年第 8 期3.16101copies/L，同时比较普通 PCR 方法的灵敏性，其检测限度为 103copies/L。说明所建立的 ALV-J/K 双重荧光定量 PCR 方法具有良好的灵敏性，比普通 PCR 灵敏性高 100 倍。3.6稳定性结果对 106、105和 104copies