DNA条形码技术在石斛分类鉴定中的应用进展_涂国章.pdf

第 14 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.2 2023 年 1 月 Journal of Food Safety and Quality Jan.,2023 基金项目:贵州省教育厅特色领域项目(黔教合 KY 字2021076)Fund:Supported by the Special Field Project of Guizhou Education Department(Qian Jiao He KY 2021076)*通信作者:涂国章,副教授,主要研究方向为毒物分析。E-mail:*Corresponding author:TU Guo-Zhang,Associate Professor,Department of Criminal Technology,Guizhou Police College,Guiyang 550005,China E-mail: DNA 条形码技术在石斛分类鉴定中的应用进展 涂国章*,张显强(贵州警察学院刑事技术系,贵阳 550005)摘摘 要要:由于石斛属植物种间、种内形态相似,地域分布范围广泛、杂交种众多,市场上混乱,现亟需一种简单、高效的鉴定方法对其进行准确地鉴定。DNA 条形码技术利用标准的一个或多个 DNA 片段对物种进行鉴定,是近年来生物学研究的热点领域,也是生物学发展最迅速的方向之一。DNA 条形码技术可以从分子水平弥补传统鉴定方法的一些不足。该技术具有良好的通用性,使得物种鉴定过程更加快速,已经广泛应用于石斛的鉴定研究中。本文综述了 DNA 条形码技术及其原理,同时讨论了基于核基因片段(ITS、ITS2)以及叶绿体基因片段(matK、rbcL、psbA-trnH)在石斛分类鉴定中的应用,以期为加大石斛分类鉴定的力度和精度,以及为DNA 条形码技术在石斛分类鉴定领域拓展和应用提供一定的理论指导依据。关键词关键词:DNA 条形码;石斛;分类鉴定 Application progress of DNA barcoding technology in Dendrobium classification and identification TU Guo-Zhang*,ZHANG Xian-Qiang(Department of Criminal Technology,Guizhou Police College,Guiyang 550005,China)ABSTRACT:Due to the similar inter-species and intra-species morphology,wide geographical distribution and numerous hybrids of Dendrobium,the market is in chaos.Therefore,a simple and efficient identification method is urgently needed to accurately identify Dendrobium.DNA barcoding,which uses one or more standard DNA fragments to identify species,is one of the hot fields in biological research in recent years and one of the fastest developing directions of biology.DNA barcoding technology can make up for some shortcomings of traditional identification methods at the molecular level.This technology has good universality,which makes the process of species identification more rapid,and has been widely used in the identification of Dendrobium.This paper summarized the DNA barcoding technology and its principle,and discussed the application of nuclear gene fragments(ITS,ITS2)and chloroplast gene fragments(matK,rbcL,psbA-trnH)in the classification and identification of Dendrobium based on the research of DNA barcoding technology in the classification and identification of Dendrobium in recent years at home and abroad,in order to increase the strength and accuracy of Dendrobium classification and identification,and provide a theoretical basis for the development and application of DNA barcoding technology in the field of Dendrobium classification and identification.KEY WORDS:DNA barcoding;Dendrobium;classification and identification DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.02.014第 2 期 涂国章,等:DNA 条形码技术在石斛分类鉴定中的应用进展 155 0 引 言 石斛(Dendrobium)属植物为兰科附生草本,全球约有12001500 个物种,中国约有 76 种,常见为:铁皮石斛、霍山石斛、金钗石斛、喉红石斛等,主要分布在云南、贵州、四川以及华南等地区1。石斛类产品含有多种生物碱、多糖、氨基酸和香豆素等成分,具有抗氧化、抗衰老、抑制肿瘤和降血糖等药用价值,同时石斛也被作为茶饮、凉拌菜、发酵食品等进行食用2。由于石斛属植物种间、种内形态相似,且地域分布范围广泛,市场上出现的石斛类药材质量参差不齐,而且劣质产品众多,导致石斛类药用产品的安全和质量难以保证3。因此为了保证药用石斛的临床疗效和使用安全,迫切需要一种简单、高效、快捷的方法对其进行准确鉴定。传统的石斛鉴定多为形态学鉴定以及显微鉴定,但是该方法带有一定的主观性,同时又缺乏大量的、专业的分类学家,导致传统的鉴定方法难以大规模推广4;除此外,色谱法、光谱法、质谱法等理化方法虽然也被经常使用,但是石斛中的化学成分及元素多样,缺乏专属性和特异性,因此无法对不同石斛进行精准的鉴别5。而 DNA 分子生物学鉴定方法的出现,尤其是 DNA条形码技术的应用,弥补了上述鉴定方法的不足,由于DNA 条形码技术具有高通量、高准确性等优点,已成为目前物种鉴定的研究热点6。本文综述了 DNA 条形码技术及其原理,同时讨论了基于核基因片段(ITS、ITS2)以及叶绿体基因片段(matK、rbcL、psbA-trnH)在石斛分类鉴定中的应用,以期为加大石斛分类鉴定的力度和精度,以及为DNA 条形码技术在石斛分类鉴定领域拓展和应用提供一定的理论指导依据。1 DNA 条形码技术及原理 长期以来,生物分类学家一直在寻找能够迅速区分不用物种的方法。2003 年,加拿大动物学家 HEBERTT等7首次提出了 DNA 条形码(也叫生物条形码)概念,很快该技术广泛的在物种分子鉴别中得到应用,成为生态学研究的重要工具,在生物分类学领域发挥了极为重要的作用。国际生命条形码联盟(Consortium for the Barcode of Life,CBOL)对 DNA 条形码的定义是:DNA 条形码为一短段能够高效鉴定物种的 DNA 标准区域8。DNA 条形码技术通过对样品提取理想的候选 DNA 片段,利用引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增和纯化选取片段,并进行测序分析序列,从而寻找目标DNA条形码,构建 DNA 条形码识别系统9。DNA 条形码技术可准确地辨别形态相似性很高的物种,该技术可以在生物任何生长发育时期的任何形态下使用,相对于传统的形态学鉴定有着明显的优势,而且该方法可以建立标准化的、统一的 DNA 条形码数据库,可方便、快速的一次性鉴定大量的样本,即使样本受损也不会影响识别结果,这是传统分类鉴定方法所无法比拟的,这为分类学研究提供了可信息化的分类学标准和有效的分类学手段,使之快速的成为动、植物等分类学领域发展最快的前沿学科之一10。研究 DNA 条形码的难点是如何找到理想的 DNA 片段,使所有的动、植物种群得到区分。在所有的基因序列中,理论上不存在一种普遍适用于所有种群生物的 DNA条形码序列。这是因为任何一个基因序列都不可能在各种生物中既表现出保守特征,同时又包含足够的序列变异信息来满足物种的辨别需求,因此在分辨不同的物种类群时需要选取不同的目标基因。理想的 DNA 条形码应当符合以下特征:(1)具有可以区分不同物种的足够的遗传变异性和一定的分化度,同时种间变异大于种内变异,具有保守性11;(2)目标 DNA 区足够短,便于 DNA 提取和PCR 扩增12;(3)具有相对保守的引物设计区,便于设计通用引物13;(4)应该包含足够多的系统进化信息,便于确认物种的系统地位14。常见 DNA 条形码在石斛分类中的应用见表 1。国际上公认的植物 DNA 条形码候选序列主要有 ITS、ITS2、psbA-trnH、matK 和 rbcL23。中国药典2015 年版收载 DNA 条形码技术指导原则建立了植物类采用ITS2/ITS 为主、叶绿体 psbA-trnH 为辅的中药材鉴定体系。目前 DNA 条形码技术被广泛应用于石斛的鉴定中,相关研究利用 DNA 技术已经成功区分多个石斛属物种24。表 1 常见 DNA 条形码在石斛分类中的应用 Table 1 Classification and application of common DNA barcoding 分类 基因片段 主要适用于对象 石斛分析对象 参考文献 核基因 ITS ITS1 ITS2 动物、植物、真菌 秋石石斛、海南石斛 铁皮石斛 霍山石斛、喉红石斛 15 16 1718 叶绿体基因 matK rbcL trnH-psbA 植物 铁皮石斛、仙桃石斛 镰刀石斛 金钗石斛、细叶石斛 1920 21 22 rpoB、rpoC1、UPA、accD、ndhJ、YCF5、psbk-psbI 植物 不单独作为核心条形码使用 23 156 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 2 基于核基因的 DNA 条形码技术在石斛分类鉴定中的应用 核基因组是串联重复排列的基因家族,其含有非常丰富的 DNA 序列,该序列常用于 rRNA 编码,但是大多数单拷贝基因和它们的内含子基因由于缺乏通用引物不利于PCR 扩增从而不能作为 DNA 条形码候选序列25。内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)(如图 1)基因位于18S rRNA(ribosomal RNA)基因和 28S rRNA 基因之间,中部被 5.8S rRNA 基因分割为 ITS1 区与 ITS2 区27。在前体RNA 形成 rRNA 时,ITS1 和 ITS2 会被剪断,不参与核糖体的形成,因此该区域所受选