TOP2A在老年复发性乳头...甲状腺癌中的表达与作用研究_姜苏原.pdf

老年医学与保健 年第 卷第 期 ，在老年复发性乳头状甲状腺癌中的表达与作用研究姜苏原，顾芹，蒋翠萍，陶晓明，孙皎复旦大学附属华东医院内分泌科，上海 通信作者：孙皎，电子信箱：摘要 目的检测 在老年复发性乳头状甲状腺癌（，）中的表达水平，研究 对 细胞系（）恶性表型的影响。方法 选取 年 月 年 月在复旦大学附属华东医院诊治的 例老年 患者（岁）的肿瘤组织，根据术后是否复发分为无复发组与复发组，检测 组 组织中拓扑异构酶（，）的表达水平。在 细胞中过表达，检测过表达效果，检测 对细胞增殖的影响，与平板克隆实验分别检测 对细胞迁移与克隆形成能力的影响。结果 复发组中 的表达水平（）较无复发组（）提高（）。在 过表达 后，过表达组中 的表达水平高于阴性无复发组（）；实验结果表明，过表达 促进的增殖能力（）；与平板克隆实验结果表明，过表达组的细胞迁移能与克隆形成能力均高于无复发组（；）。结论 老年复发性 中 显著高表达，且上调 会诱导 细胞的恶性表型，因此 可能参与老年 的复发。关键词 老年；乳头状甲状腺癌；复发；拓扑异构酶 ，：，：（）（），（）（），（）（）（），（）（）（；），；甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，在全球范围内均呈快速增长趋势。年全球新增甲状腺癌 万例，在恶性肿瘤发病谱中位居第九位。乳头状甲状腺癌（，）是甲状腺癌病例中最常见的病理分型，约占，且恶性程度较低，五年生存率超过。甲状腺癌多发于青壮年，老年人的发病率较低，但是老年甲状腺癌较年轻患者往往表现出更高的恶性程度以及更差的预后。研究显示，老年组（岁）的术后复发率高达 ，是中年组（岁）与青年老年医学与保健 年第 卷第 期 ，组（岁）的 倍与 倍；高龄组（岁）患者的肿瘤尺寸与血管侵犯的比例均显著高于老年组（岁），提示高龄患者具有更高的复发风险。因此，年龄已逐步被纳入影响甲状腺癌术后复发的独立危险因素，。随着我国老龄化的进一步深入，老年甲状腺癌术后复发患者将进一步增加。目前关于晚期转移性与复发性甲状腺癌的治疗手段以放化疗为主，但是大多数患者对放化疗均不敏感，尚缺乏有效的治疗方案。拓扑异构酶（，）是 复制和细胞周期进展中的关键因子酶，在多种恶性肿瘤中高表达，且被开发为多种肿瘤预后的标记物。最新研究表明，组织中 的表达显著高于癌旁组织，并与患者的肿瘤分期相关。本研究拟检测 在老年 患者中的表达，分析其与复发的相关性，并验证 对 细胞恶性表型的影响，以期为老年甲状腺癌的复发阐释新的机制。资料与方法 一般资料 样本采集 收集 年 月 年 月于复旦大学附属华东医院诊治的 例老年 患者的临床资料及肿瘤组织。患者中男性 例，女性 例；年龄 岁，平均年龄（）岁。根据患者是否属于术后复发分为无复发组（），复发组（）。纳入标准：（）肿瘤经病理证实为原发性乳头状甲状腺癌；（）年龄 岁，且无传染性疾病；（）初次接受甲状腺手术，符合手术标准；（）已行 次甲状腺癌手术且术后复发，符合再次手术标准。将符合（）、（）和（）项的病例纳入无复发组，符合（）、（）和（）项的病例纳入复发组。排除标准：（）接受过次甲状腺癌手术；（）其他类型的甲状腺癌；（）合并其他头颈癌病史或头颈部放射治疗史。具备上述任意 项标准的病例不纳入本研究。手术完毕后，将肿瘤组织存于液氮中，备用。主要材料与试剂人乳头状甲状腺癌细胞购自中国科学院上海细胞库；培养基、转染用减血清培养基、胎牛血清、青霉素链霉素及 均购自美国 公司；试剂盒、试剂盒及 试剂盒均购自日本 公司；的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；购自美国 公司；过表达载体 以及阴性对照载体 由上海吉凯基因化学技术有限公司构建；结晶紫、等常规试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。方法 检测肿瘤组织中 的表达水平 将肿瘤组织转移至预冷的研钵中，充分研磨至粉末状，然后使用 试剂盒完成组织的裂解 以及总 的提 取。取 ，根据 试剂盒的操作说明完成 的合成，最后应用 试剂盒进行 反应。反应体系：，上下游引物，染料，双蒸水。反应条件：预变性 ；变性 ，退火 ，延伸 ，重复 个循序。上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：。以 为内参，采用 表示计算 的相对表达量。细胞培养与转染使用 培养基添加 胎牛血清、青霉素链霉素以及 培养 细胞，培养条件为 、。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为 个，待细胞融合至 左右时，更换减血清培养基。根据 的说明书将 的过表达载体与空载分别转入 细胞，后提取总，检测 的表达水平。增殖实验 收集 细胞悬液，调整细胞密度为 个，然后接种于 孔板中，每孔 细胞液。培养、后，采用 法检测细胞活力，每个时间点设 个复孔。每孔加入 溶液（）孵育 ，然后弃去上清，加入 孔 室温振荡 ，采用酶标仪检测各孔在 处的吸光度，计算细胞增殖率：细胞增殖率 实验孔吸光度 对照孔吸光度。迁移实验 收集 细胞悬液，洗两遍，然后使用无血清的 培养基重悬细胞，调整细胞密度为 个。取 细胞液，加入 小室内部，另取 完全培养基加入小室外部，置于培养箱中培养老年医学与保健 年第 卷第 期 ，每组设 个复孔。次日，弃去小孔内部细胞液，加入适量 洗 遍，然后擦去小孔内膜表面的细胞，加入 结晶紫染色液室温孵育 。染色完毕后，洗去多余染色液，室温晾干，然后置于显微镜下随机选取 个视野，拍照计数。平板克隆实验 调整细胞密度为 个，将细胞接种于六孔板中，每孔 ，设 个复孔。每 更换一次培养液，培养 后，弃去上清，洗两次，然后加入 结晶紫染色液室温孵育。染色完毕后，洗去多余染色液，室温晾干，拍照，计算克隆数。统计学分析 采用 软件进行统计学分析。计量资料经正态分布检验符合正态分布，使用均数 标准差（）表示，组间比较采用 检验。以 为差异有统计学意义。结果 复发组 的表达高于无复发组 检测了 例 组织中 的表达水平，结果显示，复发组（）中 的相对表达水平为（），高于无复发组（）中 的表达水平（），（）。见图。注：为无复发组，为复发组；圆圈与方块分别表示无复发组与复发组。图 检测无复发组与复发组 中 的相对表达水平 过表达 促进 细胞的增殖 为确认 是否可以促进 细胞的恶性表型，本研究以常用的 细胞模型 为研究对象。首先在中过表达，验证表明 过表达组中 的表达水平高于 组（）。见图。增殖实验结果表明，过表达 后 的增殖率提高（）。见图。过表达 促进 细胞的迁移应用 实验检测 组细胞的迁移能力。组的细胞迁移数为（），高于 组中（）（）。见图。注：（）验证 过表达载体的转染效果；（）实验检测过表达 对 细胞增殖能力的影响。为阴性对照组。图 过表达 促进 细胞的增殖注：及 放大倍数为 倍。图 实验检测过表达 对 细胞迁移能力的影响 过表达 促进 细胞的克隆形成能力应用平板克隆实验检测了 组单细胞在 的克隆形成能力，结果显示 组中的克隆的尺寸较大，而 组的克隆较为稀疏且小。经统计分析，组与 组的克隆数分别为（）和（），且差异具有统计学意义（）。见图。图 平板克隆实验检测过表达 对 细胞克隆形成能力的影响 讨论 老年人是甲状腺癌的高发群体，术后易复发或转移。数据显示，甲状腺癌的死亡率与年龄呈正相关，且高度集中于老年人群（岁）。随着老龄化的发老年医学与保健 年第 卷第 期 ，展，年我国老年人口将突破 亿，占总人口的，老年甲状腺癌的发生率与死亡率也将进一步增加。转移性与复发性甲状腺癌对放化疗均不敏感、反应率低，是现阶段甲状腺癌治疗的难点与重点。靶向治疗如卡博替尼、索拉菲尼、维罗菲尼的药物在延长晚期甲状腺癌的生存期中均表现出了一定的潜力，为复发性患者带来了新的希望。但是，晚期甲状腺癌异 质性高，靶药 的反应率相 对有限，不 足。因此，以老年复发性甲状腺癌为研究对象，阐释其复发机制以期开发新的靶点，是应对老龄化国情下与日俱增的难治性晚期患者的重要策略。研究显示，老年甲状腺癌中未分化型的比例较年轻患者略有增高，约占，但是 在所有甲状腺癌类型中的比例仍然是最高的，接近，因此本研究以 为研究对象。是 代谢的关键核酶，其表达具有明显的细胞周期特异性，主要表达于 期及 后期，因此 被定位为细胞增殖的重要标记物之一。研究表明，在胃癌、乳腺癌、前列腺癌中均过度表达，且与患者的不良预后相关。最新研究证实，中 异常高表达，与肿瘤分期相关，而 是否与老年 复发相关鲜有研究。经检测，复发组 组织中 的表达显著高于无复发组，表明 上调可能是老年 术后复发的潜在信号。肿瘤的复发往往是因为肿瘤细胞获得了更强的恶性表型包括增殖、迁移能力的提升。作为调控细胞增殖的重要因子，不仅可以调控细胞增殖与周期，对细胞的迁移与侵袭也发挥了重要的调控作用。例如，在肺腺癌细胞中敲减 后会抑制细胞的增殖、迁移与侵袭；过表达 会促进宫颈癌细胞的迁移与侵袭、诱导其上皮间质转化。为确定 对 细胞表型的影响，本研究在 细胞系 细胞中过表达了该基因，经 验证确认了该基因在 中的成功过度表达。表型检测结果表明，的表达增加导致了细胞增殖、迁移与克隆形成能力的显著增强。研究表明，、通路的活化是 促进肿瘤细胞恶性表型的重要机制，同时这两条通路与 的恶性进展密切相关。因此，与 通路可能参与了 对 细胞恶性表型的诱导，仍需进一步研究。本研究中检测的样本量较小，关于 是否可以作为老年 复发的风险因子需要更多的复发性样本进一步确认。综上，本研究首次发现老年复发性 中 的异常高表达，且上调 会诱导 细胞的恶性表型，因此 可能参与老年 的复发。参考文献 ，：，（）：，：，（）：孟凡波，戴丽婷 老年甲状腺癌 例临床特点及预后分析 大连医科大学学报，（）：张金平 甲状腺癌术后复发危险因素分析 西安：西安医学院，：，（）：，：（），（）：，（）：，：吴春晓，顾凯，庞怡，等 年上海市甲状腺癌发病和死亡情况与 年间变化趋势分析 外科理论与实践，（）：贺丹，刘厚莲 中国人口老龄化发展态势、影响及应对策略 中共中央党校学报，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：（下转第 页）老年医学与保健 年第 卷第 期 ，（）：，（）：李红霞，东爱华 老年患者腹腔镜胰十二指肠切除术后胰瘘的危险因素分析 老年医学与保健，（）：陈莉华，宋雯，周进，等 前列腺电切术患者术后泌尿生殖系感染炎症因子与影响因素分析 中华医院感染学杂志，（）：，（）：，（）：胡昌伦，罗健，张杨，等 中西医结合治疗糖尿病神经源性膀胱的疗效分析 重庆医学，（）：，（）：张选举，江铎，熊丙建，等 经尿道前列腺电切术后并发尿路感染的相关临床影响因素研究 中国性科学，（）：，：，（）：，（）：王鹏，郭小鹏，成俊 老年患者经尿道前列腺电切术后尿路感染的危险因素 中国老年学杂志，（）：黄小瑜，潘敏，易燕桃，等 临床药师对前列腺电切术患者中预防用抗菌药物抗感染的方案评估 抗感染药学，（）：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：夏世金）（上接第 页），（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：邓春光）