PEDV、TGEV双重Ta...CR方法的建立及病原学调查_陈秋勇.pdf

陈秋勇，陈渊泉，陈如敬，等.PEDV、TGEV 双重 TaqMan 实时荧光定量 PCR 方法的建立及病原学调查J.福建农业学报，2022，37（11）：13811387.CHENQY,CHENYQ,CHENRJ,etal.DuplexTaqManqPCRforDetectingPorcineEpidemicDiarrheaandTransmissibleGastroenteritisVirusesandEpidemicStudyinFujianJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：13811387.PEDV、TGEV 双重 TaqMan 实时荧光定量 PCR 方法的建立及病原学调查陈秋勇1，陈渊泉2，陈如敬1，车勇良1，吴学敏1，刘玉涛1，周伦江1*，王隆柏1*（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州350013；2.福建省仙游县畜牧兽医局，福建莆田351200）摘要：【目的】实现猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的快速鉴别诊断，并调查分析福建省 20192021 年 PEDV 和 TGEV 流行情况。【方法】根据 PEDV 的 N基因和 TGEV 的 S基因序列分别设计特异性引物和标记 FAM、VIC 荧光报告基团的探针，建立、优化双重荧光定量 PCR 反应条件和体系，并检测其敏感性、特异性和重复性。应用该方法对福建省 20192021 年收集的 297 份疑似腹泻病料进行病原检测。【结果】建立的方法对 PEDV 和 TGEV 的最低检测限均为 10 拷贝L1，比普通 PCR 检测灵敏度提高 100 倍；对其他常见猪病原不发生非特异性反应；批内、批间变异系数均小于 1%。福建省 297 份临床样本检测结果显示，单 PEDV 感染率为 88.89%，单 TGEV 感染率为 1.01%，PEDV 和 TGEV 混合感染率为 3.37%。【结论】本研究建立的方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等特点。福建省内 20192021 年以 PEDV 感染为主，TGEV 感染率低，存在 PEDV、TGEV 混合感染的情况。关键词：猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；双重荧光定量 PCR；流行情况中图分类号：S858.28文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11138107Duplex TaqMan qPCR for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea and TransmissibleGastroenteritis Viruses and Epidemic Study in FujianCHENQiuyong1,CHENYuanquan2,CHENRujing1,CHEYongliang1,WUXuemin1,LIUYutao1,ZHOULunjiang1*,WANGLongbai1*（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Animal DiseaseControl Technology Development Center,Fuzhou,Fujian350013,China;2.Bureau of Animal Husbandry and VeterinaryMedicine of Xianyou County,Putian,Fujian351200,China）Abstract:【Objective】ATaqManprobe-basedduplexreal-timePCRforrapiddetectionofporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)andtransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV)wasdeveloped.Astudywasconductedusingthemethodologytoanalyzetherelated20192021epidemicoccurredinFujian.【Method】SpecificprimersandprobeslabeledwithFAMandVICweredesigned to amplify the N gene of PEDV and the S gene of TGEV,respectively.A reaction system for the assay wasestablished,optimized,andtestedforsensitivity,specificity,andrepeatability.Theassaywasusedfortheviraldetectionon297suspectedclinicspecimenscollectedfrom2019to2021foranepidemiologystudy.【Result】ThenewlydevelopedduplexqPCRmethodologyshowedasensitivityof10copiesL1onPEDVandTGEV,whichwas100timeshigherthanthatofregularPCR.Therewerenocrossreactionswithothercommonviruses.Theinter-andintra-assayshadvariationsonCt收稿日期：20220808初稿；20220825修改稿作者简介：陈秋勇（1990），男，硕士，研究实习员，主要从事猪病原学及免疫学研究（E-mail：）*通信作者：周伦江（1973），男，博士，研究员，主要从事猪传染病防治研究（E-mail：）；王隆柏（1977），男，硕士，副研究员，主要从事猪传染病防治研究（E-mail：）基金项目：福建省科技计划公益类专项（2021R10260015）；福建省农业科技创新联盟专项（CXLM202206、CXLM2021004）；福建省科技重大专项（2021NZ029023）福建农业学报2022，37（11）：13811387http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.002valuesbelow1%.Onthe297specimens,theinfectionrateofPEDVwas88.89%,thatofTGEV1.01%,andthatofbothPEDVand TGEV 3.37%.【Conclusion】The established duplex qPCR had high sensitivity,specificity,repeatability,andreproducibilityfordetectingPEDVandTGEV.The20192021epidemicinvolvingthevirusesappearedtobemostlyPEDVwithlowincidentsofmixedTGEVandPEDV/TGEVinfection.Key words:Porcineepidemicdiarrheavirus；transmissiblegastroenteritisvirus；duplexreal-timePCR；epidemiology0引言【研 究 意 义】猪 流 行 性 腹 泻 病 毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）是引起猪病毒性腹泻的主要病原13。近年来，猪病毒性腹泻疫苗的使用对该类疫病防控具有一定的保护效果，但是由于疫苗毒株与流行毒株之间的遗传差异、免疫原性和混合感染等问题，猪群腹泻类疫病仍发生严重4,5，给我国养猪业造成了巨大的经济损失2,6。对腹泻类疫病病原的快速诊断是有效防控疫病蔓延的关键。因此，建立一种能够同时对 PEDV和 TGEV 病原鉴别诊断、操作简便、可大样本快速检测的方法具有重要意义。同时应用该方法对福建地区近年的疑似腹泻病料进行检测，可以明确福建省 猪 群 腹 泻 的 流 行 动 态。【前 人 研 究 进 展】PEDV 和 TGEV 两种病毒的实验室诊断方法主要有病毒分离、免疫组织化学、电镜和普通 PCR 等常规的诊断技术。传统方法由于操作繁琐、耗时长且成本较高，应用范围大大受限7。探针法荧光定量检测方法（Quantitativereal-timePCR-TaqMan，qPCR-TaqMan）不仅能够在短时间内定性检测病原，而且还能通过荧光信号的收集实现病毒含量的定量分析8,9，随着分子生物学的发展及检测成本的下降，该方法在动物检疫中得到广泛的应用，如猪瘟、猪圆环病毒 2 型和口蹄疫等病毒的检测10,11。前期我们已报道了福建省 20122018 年的 PEDV 和 TGEV 感染率分别为 72.74%和 7.89%12。被 PEDV 或 TGEV感染的猪主要临床症状表现为腹泻、呕吐和脱水，各年龄阶段均可感染13,14，单凭借临床症状和解剖病理变化难以鉴别诊断，亟需建立一种快速鉴别诊断的方法，并应用该方法对福建省 PEDV 和 TGEV 流行情况进行调查。【本研究切入点】目前关于PEDV 和 TGEV 进行双重 PCR 检测方法还鲜有报道，而关于 20192021 年福建省 PEDV 和 TGEV 的流行情况尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究建立了 PEDV 和 TGEV 双重荧光定量 PCR 方法，并利用该方法调查福建省 20192021 年腹泻病原学情况，解决 PEDV 和 TGEV 鉴别诊断和疫病预警难题。1材料与方法1.1病毒、菌株及质粒猪瘟病毒（Classicalwinefevervirus，CSFV）、蓝耳病病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、伪 狂 犬 病 毒（Pseudorabiesvirus，PRV）、猪圆环病毒 2 型（Porcinecircovirustype2，PCV-2）、猪轮状病毒（Porcinerotavirus，PoRV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroente-ritisvirus，TGEV）阳性核酸均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存；大肠杆菌 DH5 和 pEASY-T1 载体购自北京全式金生物技术有限公司。1.2主要试剂和仪器病毒 DNA/RNA 提取试剂盒购自 Qiagen 公司；反转录试剂盒 EasyScriptOne-StepRT-PCRSuperMix、克隆试剂盒 pEASY-T1SimpleCloningKit、琼脂糖凝胶 DNA 回收纯化及普通小质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；荧光定量 PCR 反应液TaqManFastqPCRMasterMix（HighRox）购自生工生物工程（上海）有限公司。ABIQ3 型荧光定量 PCR 仪。1.3引物、探针设计及合成根据 GenBank 数据库中 PEDVAJ1102 株 N 基因（登 录 号：JX188454.1）和 TGEVWH-1 的 S 基 因（登录号：HQ462571.1）序列，设计特异性引物和探针，其序列如表 1 所示。1.4病毒核酸提取及模板的制备参照病毒 DNA/RNA 提取试剂盒说明书提取病毒 DNA/RNA，取 RNA 按照 Easy