UPLC-MS_MS测定葡...酒中类黄酮化合物方法的建立_王一名.pdf

16研究报告2023.1中外葡萄与葡萄酒SINO-OVERSEAS GRAPEVINE&WINEUPLC-MS/MS测定葡萄酒中类黄酮化合物方法的建立王一名，卫晓红，王忠一，于晓静，吴帅*（烟台市食品药品检验检测中心，山东烟台 264000）摘 要：采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）对葡萄酒中的类黄酮化合物进行测定。样品过0.22 m聚四氟乙烯（PTFE）滤膜后上样分析，用HSS T3色谱柱进行分离，以含0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸-水溶液为流动相进行梯度洗脱。质谱采用电喷雾离子源（ESI），以多反应监测（MRM）模式进行检测。在优化后的方法中，待测化合物在相应质量浓度范围内的线性关系良好，相关系数R均大于0.99；检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.15 gL-1和0.312 gL-1；加标回收率为69.2%99.8%，相对标准偏差（RSD）均小于5.0%。用新建立的方法对葡萄酒样品进行分析，结果表明，葡萄酒中检出花旗松素、槲皮素、杨梅素、杨梅苷等13种组分；所检酒样中均未检出芦丁、刺槐苷、表没食子儿茶素没食子酸酯和水仙苷。该方法快速、准确，适用于葡萄酒中类黄酮物质检测的定性和定量分析。关键词：类黄酮；超高效液相色谱-串联质谱法；葡萄酒；测定中图分类号：S663.1；O657.63 文献标志码：ADOI：10.13414/ki.zwpp.2023.01.003收稿日期：2022-10-21基金项目：市场监管总局科技计划资助（2020MK061）作者简介：王一名（1991），女，工程师，硕士，主要从事食品检测分析工作。E-mail:*通信作者：吴帅（1979），女，正高级工程师，博士，主要从事食品分析工作。E-mail:Establishment of UPLC-MS/MS Method for Determination ofFlavonoid Compounds in WineWANG Yiming,WEI Xiaohong,WANG Zhongyi,YU Xiaojing,WU Shuai*(Yantai Testing Center for Food and Drug,Yantai 264000,China)Abstract：A method for the determination of flavonoids in wines by ultra high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry was explored.The samples were filtered and loaded onto a T3 column using a gradient elution of 0.1%formic acid-acetonitrile and 0.1%formic acid-water for the separation,then analyzed by mass spectrometry with an electrospray ion source(ESI)in multiple reaction monitoring(MRM)mode,and finally quantified by the external standard method.The calibration curves of components showed good linearities(R0.99)in their detection ranges.The limits of detection and limits of quantification were in the range of 0.1-5 gL-1 and 0.3-12 gL-1,respectively.The average recoveries at low,medium and high spiked levels ranged from 69.2%to 99.8%,with the relative standard deviations all less than 5.0%.When the method was applied to commercial wine samples,it was found that 13 components including taxifolin,quercetin,myricetin and myricitrin were identified while their mass concentrations were significantly different among the wines.In contrast,all selected samples didnt contain lutin,robinin,epigallocatechin gallate and isorhamnetin-3-o-glucoside.The method is quick,accurate and suitable for the qualitative and quantitative analysis of flavonoids in wines.Key words：flavonoid;UPLC-MS/MS;wine;determination2023(1):16-23172023.1研究报告中外葡萄与葡萄酒SINO-OVERSEAS GRAPEVINE&WINE类黄酮化合物是自然界存在的酚类化合物中最大的一个亚类，在植物中广泛存在。其基本骨架具有C6=C3=C6结构，即由2个芳香环A和B，通过中央三碳链相互连结而成。已经有4000多种类黄酮化合物被分离鉴定，由于化学结构的不同，这些化合物呈现出不同的特性。葡萄酒中的类黄酮根据其结构分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷-3-醇等，主要包括槲皮素、杨梅素、儿茶素等组分。类黄酮物质是葡萄酒中主要的苦味及涩味物质1-3，构成了葡萄酒的基本骨架，有助于增强酒的结构感。在葡萄酒成熟过程中，这些苦味、涩味和酸味物质发生变化，形成复杂的聚合物，提高味感质量。此外，类黄酮具有抗氧化的功效，通过自身氧化可降低葡萄酒变质的速度，有利于葡萄酒成熟过程中醇香的产生。在植物体内的多酚物质中，多数类黄酮化合物具有生理或药理活性，对人体健康有重要作用4，除了可作为抗氧化剂和自由基清除剂5外，还能抗炎、抑菌、抗病毒、预防高血压以及抑制血栓形成等6-7。越来越多的研究表明，类黄酮化合物具有很高的医用价值，如山奈酚和槲皮素具有抗癌、心脏保护和抗炎作用8；槲皮素对心血管疾病高危人群的健康有积极影响；柚皮素具有神经保护和抗氧化特性9。因此，研究建立一种简便、快速、准确、灵敏并能够同时测定葡萄酒中多项类黄酮组分的分析方法显得尤为重要。目前，检测类黄酮的方法主要有分光光度法10、高效液相色谱法11、薄层色谱法12、毛细管电泳法13、核磁共振法14、液相色谱-质谱联用法15-16和红外光谱法17等。近年来，液相色谱-质谱联用法以准确度高、灵敏度好、分析速度快等特点已广泛应用于类黄酮检测的各个领域，包括植物18-19、中成药20和食品21等，如毛慧慧等22采用液质联用技术分离鉴定了银线莲中两种黄酮类化合物，白海玉等23利用液质联用技术对野菊花中的黄酮成分进行了分析，均取得良好的效果。但是，采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS），对葡萄酒进行多指标类黄酮化合物的定量分析却少见报道。迄今为止，对葡萄酒中酚类物质的研究报道仍以生物活性、感官特性等为主。本研究建立了一种测定葡萄酒中17种类黄酮物质含量的超高效液相色谱-串联质谱法，对葡萄酒中类黄酮化合物的含量进行了定量分析，结果准确、可靠，可以作为葡萄酒中类黄酮物质定量检测的技术依据，为葡萄酒中这类化合物的综合分析提供参考。1 实验部分1.1 主要仪器与试剂TQ-S超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Waters公司）；赛多利斯CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。标准品（纯度98%）：花旗松素（Taxifolin）、杨梅素（Myricetin）、杨梅苷（Myricitrin）、表儿茶素（Epicatechin）、儿茶素（Catechin）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin），购自成都普菲德生物技术有限公司；槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、芦丁（Rutin）、刺槐苷（Robinin），购 自 成 都 普 瑞 法 科 技 开 发 有 限 公 司；柚 皮 素（Naringenin）、没食子儿茶素（Gallocatechin），购自上海安谱实验科技股份有限公司；金丝桃苷（Quercetin-3-galactoside）、异槲皮苷（Quercetin-3-O-glucodise），购自上海甄准生物科技有限公司；表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate），购自坛墨质检；水仙苷（Isorhamnetin-3-O-glucoside），购自Panphy-chemicals。葡萄酒购买于超市。甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；实验用纯水由Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）制备。1.2 实验条件1.2.1 UPLC条件色谱柱为HSS T3色谱柱（2.1 mm100 mm，1.8 m，美国Waters公司）；流动相A为有机相（0.1%甲酸-乙腈溶液），B为水相（0.1%甲酸-水溶液）；柱温35；流速300 Lmin-1；进样量2 L。洗脱程序见表1。1.2.2 MS条件电喷雾离子源（ESI），同时采用ESI（毛细管电压3.5 kV）和ESI-（毛细管电压2.9 kV）模式切换扫描；多反应监测模式（MRM）；离子源温度为150，去溶剂气温度为500，去溶剂气流量为1000 Lh-1，锥孔气18研究报告2023.1中外葡萄与葡萄酒SINO-OVERSEAS GRAPEVINE&WINE流量为150 Lh-1，碰撞气流量为0.15 mLmin-1。类黄酮化合物的定性/定量离子对、碰撞能量（CE）及锥孔电压（CV）见表2。1.3 实验方法1.3.1 标准品溶液和模拟酒基的配制将标准品用甲醇溶液配制成1000 mgL-1的标准储备液，置于20 保存备用。使用时，将标准储备液用甲醇溶液逐级稀释成所需标准工作液，且现用现配。取120 mL食用酒精和5 g食品级酒石酸，移到1 L容量瓶中，用去离子水定容，即得到模拟酒基。1.3.2 样品处理葡萄酒在分析前室温避光保存。开瓶后，马上转移到棕色瓶中，以避免氧化，置于4 避光保存。上机前取2 mL样品过0.22 m滤膜过滤，也可以根据实际测定结果取样1 mL稀释至适当浓度，过滤膜后上机分析。2 结果与讨论2.1 质谱参数优化为获得各待测化合物的最优质谱参数，本研究利用注射泵直接进样，将1 mgL-1的标准工作液以0.01 mLmin-1流速注入离子源，分别测定了每一种化合物在ESI和ESI-模式下的质谱信号强度。由于类黄酮类化合物结构中既具有-OH基团，又具有碱性O原子24，因此在正、负离子模式下均具有相应的质谱信号。通过对比后发现，槲皮素、山奈酚、杨梅苷、芦丁等在正离子模式下的响应强度较强，因此选择ESI电离模式；而柚皮素、杨梅素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等化合物在负离子模式下的响应强度较强，因此选择ESI-电离模式。在各化合物最优的离子化模式下，分别对母离子进行碰撞解离，二级扫描得到裂解碎片离子。通过对CE的优化选取响应值高、干扰小的碎片离子用于定性和定量分析。优化后的质谱参数见表2。2.2 色谱条件优化2.2