PET水解酶传统与智能分子设计研究进展_苗瑞菊.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 46 54Current Biotechnology ISSN 2095-2341进展评述进展评述ReviewsPET水解酶传统与智能分子设计研究进展苗瑞菊1，2，丁尊丹2，田健2，张红兵1*，关菲菲2*1.河北经贸大学生物科学与工程学院，石家庄 050061；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081摘要：塑料由于其耐久性和耐降解性造成的环境污染日趋严重，而塑料废弃物的处理回收方法存在着缺陷。聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）是应用最广泛的塑料类型之一，但在自然条件下很难被降解。近年来，虽然多种具有PET降解活性的酶被发现，但这些酶的催化活性和热稳定性难以支撑实际工业所需，因此提高PET水解酶的降解能力已成为研究热点而备受关注。脂肪酶、角质酶、IsPETase和IsMHETase是目前研究最为广泛的PET水解酶，就这几种酶的结构、活性特征进行了总结，重点阐述了传统蛋白质工程和人工智能分子设计在增强PET水解酶应用性能方面的研究进展。期望塑料降解酶可以进一步发展优化，为循环塑料经济做出有价值的贡献。关键词：PET水解酶；蛋白质工程；智能分子设计；机器学习DOI：10.19586/j.20952341.2022.0160 中图分类号：Q55，TQ321.4 文献标志码：AResearch Advances on Traditional and Intelligent Molecular Design of PET HydrolasesMIAO Ruiju1，2，DING Zundan2，TIAN Jian2，ZHANG Hongbing1*，GUAN Feifei2*1.College of Bioscience and Engineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China；2.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，ChinaAbstract：Environmental pollution caused by plastic is becoming more and more serious due to its durability and degradation resistance，and there are defects in the treatment and recycling methods of plastic waste.Polyethylene terephthalate（PET）is one of the most widely used types of plastic，but it is difficult to degrade under natural conditions.In recent years，although a variety of enzymes with PET degradation activities have been discovered，the catalytic activity and thermal stability of these enzymes are difficult to support practical industrial needs.Therefore，improving the degradation ability of PET hydrolase has become a research hotspot and has received attention.Lipase，cutinase，IsPETase and IsMHETase are the most widely studied PET hydrolases.The structure and activity characteristics of these enzymes were summarized，with emphasis on the research progress of traditional protein engineering and artificial intelligence molecular design in enhancing the application performance of PET hydrolase.It was expected that plastic-degrading enzymes could be further developed and optimized to make valuable contributions to the circular plastics economy.Key words：PET hydrolase；protein engineering；intelligent molecular design；machine learning合成塑料属于长链聚合物，通常是化石燃料的副产品，制成的产品品质优良，日常生活中应用广泛，自 1950 年问世伊始就得以大规模生产使用1。据统计，2018年全球塑料产量为3.59亿t，2019增长到3.68亿t，该数字还在持续增长2。由于大多数塑料用品生产成本低，导致重复使用的收稿日期：20220920；接受日期：20221009基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFC2100301）联系方式：苗瑞菊E-mail: *通信作者 张红兵E-mail:;关菲菲E-mail:苗瑞菊，等：PET水解酶传统与智能分子设计研究进展意愿不高，大部分是一次性使用，塑料垃圾乱扔乱放屡禁不止，如渔具、塑料瓶、购物袋等一次性塑料用品污染环境的现象屡见不鲜，不仅导致化石资源过度消耗，还会造成严重的环境污染。由于塑料的降解性差，在环境中不会完全消失，而是通过机械作用生成直径小于5 mm的微塑料颗粒转移到土壤和海洋中，甚至在空气中也能检测到3-4，在土壤中直接影响土壤微生物的功能和结构多样性，危害植物健康，还可以通过食物链或呼吸等方式在动物及人体中富集5。聚对苯二甲酸乙二醇酯是一种以对苯二甲酸（terephthalic acid，TPA）、乙二醇（ethylene glycol，EG）为单体的聚酯塑料，具有重量轻、绝缘性好、强度和透明度高、热学性能好、耐化学腐蚀等特点，被广泛应用在聚酯织物、普通塑料容器、包装材料以及电子设备中，年消费量约占世界塑料总产量的13%6。虽然PET和其他合成聚合物塑料被认为是无毒的，但它们是潜在的有毒着色剂和添加剂的载体，对全球生态系统和人类健康造成严重威胁1，5。本文对脂肪酶、角质酶、IsPETase 和 IsMHETase 这 4种 PET水解酶的发现历史、结构特点与催化机制进行了介绍，重点阐述了PET水解酶传统蛋白质工程与人工智能分子设计的研究进展。以期为进一步设计和构建高效PET水解酶、提高热稳定性以及拓宽其他生物技术应用领域提供有益参考。1塑料废弃物的处理现状截至目前，塑料废弃物的处理方法主要有垃圾填埋、焚烧、机械回收和化学回收四种方法。填埋法是将塑料作为垃圾进行填埋，最终沉积在土壤和海洋中，造成地下水污染7。在“太平洋垃圾带”中，塑料垃圾的累积量已达到了7万t，而且仍在以惊人的速度增长8。焚烧法是将塑料作为一种能源，通过焚烧获取能量，如日本等土地资源匮乏的国家，更倾向于这种处理方法，但这一过程通常会释放出有毒物质，如呋喃和二噁英等，造成环境的二次污染9。回收法是将塑料废物转化为可重复使用的材料，是解决塑料废物污染的一种经济有效的方法，其中机械回收要经过分类、粉碎、融化、造粒等过程，由于不会改变材料的基本结构，回收塑料与非回收塑料可共同作为原料用于工业生产10-11，但机械回收不适用于温度敏感性差的塑料和多层塑料12，材料变质现象也较为常见。此外，回收法还存在新PET材料在寿命期内会自发降解13、塑料垃圾中潜在的有毒有机化合物仍然会危害环境和公共健康14、分类带来的经济和适用性等问题15。化学回收法则是通过水解、糖酵解或甲醇水解，将塑料解聚成单体或其他有用的产品，常需要高温、高压、催化剂等苛刻条件，成本较高，还存在产生有毒副产物的风险10，16。因此，为减少塑料垃圾的影响，实行新的具有环保意义的回收策略成为当务之急，生物降解法应运而生，该方法是利用微生物产生的酶（通常是水解酶17，在水分子的帮助下降解聚合物）将塑料聚合物裂解为单体及其他降解物，进一步作为微生物的碳源和能源18。与传统方法相比，生物降解法条件温和，经济环保，具有不可替代的优势和广阔的发展前景。目前在生物降解的塑料中，有关PET的研究最多，已发现多种放线菌、藻类、细菌和真菌具有降解PET的能力19-20。自2005年Mller等21在 Thermobifida fusca 中首次分离出了具有降解PET活性的酶以来，研究人员在降解PET的微生物中分离得到了脂肪酶22、角质酶23-24、IsPETase 和 IsMHETase25等一系列水解酶，它们水解 PET 的酯键生成对苯二甲酸双羟乙酯 Bis（2-hydroxyethyl）terephthalic acid，BHET、对苯二甲酸单羟乙酯 Mono（2-hdroxyethyl）terephthalic acid，MHET、TPA和EG等组分（图1），水解产物可用于合成新的PET材料26或生产其他高附加值产品，如柴油级燃料、多环芳烃（polycyclic aromatic，PCA）、没食子酸（gallic acid，GA）、邻苯三酚（pyrogallol，PG）等27。Rorrer等28利用己二烯二酸、丙烯酸等物质与PET部分结构产物BHET联合制造了新型高性能玻璃纤维增强塑料。总之，PET水解酶的发现和应用降低了 PET 回收再利用的成本，促进了PET循环可持续经济的发展。尽管许多PET水解酶已被表征，但PET分子量高、结晶度高、疏水性强等特性限制了酶解效率29，加之PET水解酶本身催化效率低、稳定性和生产性能差，难以满足工业需求，因此采用酶工程方法提高PET水解酶的降解性能。定向进化、半理性设计等传统的分子设计方法需要依赖高通量筛选技术，然而在对酶的进化机制、结构等基础信息了解有限的情况下，利用人工智能分子设计方法辅助蛋白质工程，比传统方法更加高效、准确30。47生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology2PET水解酶2.1脂肪酶脂肪酶作为一类多功能酶，不仅能水解长链甘油三酯生成脂肪酸和甘油，还参与氨解和醇解31。近年来，研究发现一些脂肪酶对PET纤维或者薄膜有降解作用。这些脂肪酶具有相同的/水解酶折叠结构、Ser-His-Asp催化三联体和氧阴离子空穴结构，活性中心因埋藏在盖子结构域中，不利于与底物结合，因此影响水解活性32。据报道，Thermomyces lanuginosus Lipase（TlLip）具有PET水解能力，但与角质酶相比水解产物的释放量要低33。Candida antarctica Lipase B（CaLipB或 CALB）不能直接用于降解 PET，但对 BHET 和MHET 有较高活性，Carniel 等22利用 CaLipB 与Humicola insolens Cutinase（HiCut）协同作用使得从PET到TPA的回收率提高了7.7倍。2.2角质酶角质酶属于丝氨酸水解酶类，结构中含有的螺旋、折叠和催化三联体（Ser-His-Asp），其主要作用于中短链酯类（C8-C10）34-35。角质酶与脂肪酶同源性很高，但仍有独特之处，一是没有盖子结构域，催化位置直接暴露在溶剂中36，