UPLC-QTOF-MS_...芦巴盐制前后的化学成分差异_王祎.pdf

基金项目：“兴辽英才计划”科技创新领军人才（）作者简介：王祎，男，研究方向：中药炮制学，：通信作者：郑彧，男，博士研究生，副教授，研究方向：中药炮制学，：，：结合主成分分析法考察胡芦巴盐制前后的化学成分差异王祎，刘颖，叶斌斌，郑彧（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连）摘要：目的 利用超高效液相四极杆飞行时间串联质谱（）结合多元统计分析筛选并鉴定胡芦巴和盐胡芦巴的差异性成分。方法 采用 反相色谱柱 乙酸乙腈梯度洗脱，在正离子模式下采集质谱数据，应用 等软件进行主成分分析（）和偏最小二乘判别分析（），筛选胡芦巴与盐胡芦巴的差异性成分。通过质谱提供的精确分子量、碎片离子并结合文献数据鉴定偏最小二乘判别分析中 值 的差异性成分的结构。结果 利用准分子离子、二级质谱图、特征碎片离子及其他碎片离子等信息，并参考相关文献报道鉴定了胡芦巴与盐胡芦巴中的 个差异性成分，其中包括 个黄酮碳苷类化合物，个甾体皂苷类化合物以及 个生物碱类化合物即胡芦巴碱和 个脂肪族化合物即亚麻酸乙酯。通过比较各化合物在胡芦巴和盐胡芦巴样品的质谱中的响应值，盐制后黄酮碳苷类成分响应升高，甾体皂苷中的呋甾烷醇型甾体皂苷响应降低，而螺甾烷醇型 异螺甾烷醇型甾体皂苷响应升高。结论 盐制促进了胡芦巴中黄酮碳苷类成分的溶出，并使胡芦巴中皂苷类成分发生了结构转化。关键词：胡芦巴；盐制；超高效液相四级杆飞行时间串联质谱；主成分分析中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，）：（）（）（），药学研究 .1，.1：；胡芦巴为豆科植物胡芦巴（）的干燥种子，主要分布于我国宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙古等省区，是我国传统的药食两用植物和香料。中国药典中载有胡芦巴、盐胡芦巴两个品种。胡芦巴性温味苦，归肾经，温肾助阳，祛寒止痛，用于肾阳不足。在中医理论中有“入盐走肾脏仍仗软坚”，认为盐制可以引药入肾，发挥软坚散结的作用。胡芦巴经盐制后可以增强温肾阳、逐寒湿的功效。我们课题组在早期研究中证明了盐胡芦巴的降脂作用优于胡芦巴。胡芦巴的化学成分主要包括胡芦巴碱、皂苷类、黄酮类、膳食纤维、胡芦巴油脂、羟基异亮氨酸等，这些化学成分已经被报道具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、保肝等多种药理活性。我们课题组早期基于响应面法优化了盐胡芦巴的炮制工艺，并发现胡芦巴盐制后，多糖、薯蓣皂苷元、胡芦巴碱含量升高，羟基异亮氨酸含量降低。中药的炮制在中国有着悠久的历史，炮制通过促进中药中化学成分之间的转化以及药效成分的溶出，从而发挥减毒增效的作用。例如，补骨脂经盐制总黄酮含量呈现上升趋势，这可能是盐制过程导致补骨脂种皮破碎，使得其成分更易溶出；知母中的甾体皂苷类成分在盐制过程中发生转化。目前，关于胡芦巴盐制后化学成分变化的研究较少。因此，本研究使用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法（）分析胡芦巴与盐胡芦巴中的化学成分，采用主成分分析（）以及偏最小二乘判别分析（）筛选胡芦巴与盐胡芦巴中的差异性成分，利用高分辨质谱提供的精确分子量、二级质谱结合文献数据鉴定这些差异性成分的结构。探究盐制对胡芦巴中化学成分的影响，为阐明胡芦巴盐制的机理提供实验依据。试药胡芦巴购自亳药千草中药饮片公司（批号：，产地：安徽蒙城）经王添敏教授鉴定为豆科植物胡芦巴（）的种子。参照课题组早期优化的盐制方法制备盐胡芦巴，即：胡芦巴，加入含盐量 的盐水，闷润 ，在 下烘箱烘制 。方法 样品制备胡芦巴和盐胡芦巴粉粹，过 目筛，精密称定后以 倍量甲醇超声提取 ，离心 取上清液（平行 份）进 分析。取胡芦巴和盐胡芦巴各样品等量混合作为 样品。色谱和质谱条件色谱条件 ，离子源：（）。色谱柱：反相色谱柱（，）。柱温 ，流速，进样量 ，流动相：乙酸（）乙腈（），梯度洗脱，；，。质谱条件 离子源（），毛细管电压，碰撞电压 ，锥孔电压 ，雾化气压力，干燥气流速 ，干燥气温度 ，扫描范围 。数据统计分析将 的结果加载到安捷伦 工作站软件上，该软件可以在分析的每个步骤中可视化原始数据，而不会丢失值。离子强度图显示了保留时间、和强度的信息，以及用于进一步分析的质谱图和色谱图。将从 获得的数据转换为包含 、保留时间和离子强度信息的表格。从所有样品中排除质控样品中 值大于 的峰，并将剩余峰用于多元统计分析。将 软件应用于 和。然后选择 值大于、组间差异 值小于的离子，通过二级质谱（）进行进一步鉴定。结果 胡芦巴和盐胡芦巴的 和 分析胡芦巴和盐胡芦巴在正离子模式下的总离子流图（）见图 所示。在胡芦巴和盐胡芦巴 图中 的离子响应出现差异，提示盐制使胡芦巴中的化学成分发生变化。将各样本的 数据导入（：）转换为包含 ，保留时间和峰响应的表格，将表格导入 软件进行 和 分析。分析结果表明胡芦巴和盐胡芦巴样本聚集良好。进一步采用 筛选胡芦巴和盐胡芦巴中的差异性成分，选择 值大于、组间差异 值小于的成分进行鉴定。胡芦巴和盐胡芦巴差异性成分鉴定通过质谱提供的精确分子量以及 数据，结合参考文献，鉴定了胡芦巴和盐胡芦巴中的 个差异性成分的结构。化合物 为胡芦巴碱，是胡芦巴中的主要活性成分。胡芦巴中含有大量黄酮碳苷，尽管药学研究 .1，.1胡芦巴；盐胡芦巴图 胡芦巴及盐制品正离子模式下的总离子流图本试验采用正离子模式测定胡芦巴的化学成分，对于差异性成分中黄酮的鉴定则配合了负离子模式下的靶向二级质谱。黄酮碳苷在负离子模式下易产生、等碎片，这些碎片信息提示黄酮碳苷中糖的类型例如，和提示存在六碳糖苷，和提示存在五碳糖苷 。由于质谱不能鉴定糖的种类和连接位置，因此胡芦巴生、盐品差异性黄酮类化合物的鉴定参考了文献中报道的胡芦巴中含有的黄酮碳苷的名称以及其在 柱上的保留时间，糖的结构只鉴定了其类型。基于以上分析化合物 被鉴定为黄酮类化合物。化合物 和 在正离子模式和负离子模式下的准分子离子峰分别为 、，提示其分子式为。给出碎片离子峰 、。因此鉴定该两个化合物为芹菜素，双六碳糖苷，即 或其异构体。化合物，在正离子模式和负离子模式下的准分子离子峰分别为 、，提示其分子式为。给出碎片离子峰 、。因此鉴定该 个化合物为芹菜素六碳糖五碳糖苷或芹菜素 五碳糖 六碳糖苷，即、或其异构体。该 个黄酮碳苷类化合物在盐胡芦巴中的响应较高，提示其盐制后含量升高。除黄酮碳苷外，胡芦巴中还含有大量的甾体皂苷，苷元类型包括呋甾烷醇型（原，）及其 环闭环的苷元即螺甾烷醇型 异螺甾烷醇型。其中的呋甾烷醇型甾体皂苷在 连有羟基，因此在质谱中的准分子离子峰为同时还会观察到其 脱水的离子峰。在此基础上 的中性丢失生成碎片 提示其 连有葡萄糖。而螺甾烷醇型 异螺甾烷醇型甾体皂苷在质谱中可形成，的准分子离子峰，在此基础上的 中性丢失为 环开裂产生。甾体皂苷在质谱中主要产生失去糖形成的碎片峰，、分别提示存在六碳糖、甲基五碳糖和五碳糖。、（，）、（，）的 碎 片 峰 提 示 苷 元 为 原 和 原 以及 和。、（，）、（，）提示苷元为原 和原 以及 和。、（，）、（，）、（，）提示苷元为原 和原 以及 和。、（，）、（，）、（，）、（，）提示苷元为原 和原 以及 和。在上述苷元的碎片基础上生成 中性丢失碎片提示 和 之间存在双键。此外，在 柱上 构型的甾体皂苷先于 构型的洗脱，中基于这个洗脱规律对甾体皂苷的 差向异构体进行鉴定。由于质谱不能鉴定糖的结构以及连接位置，因此在进行甾体皂苷的鉴定时仅对糖的类型进行了鉴定，如六碳糖、五碳糖、甲基五碳糖。基于以上分析，共鉴定胡芦巴生、盐品中的差异性皂苷 个。其中 个为呋甾烷醇型甾体皂苷，个在盐制后响应降低；个为螺甾烷醇 异螺甾烷醇型甾体皂苷，在盐制后响应升高。推测胡芦巴中的呋甾烷醇型甾体皂苷在盐制过程中失去 位葡萄糖，随后发生侧链环合，生成螺甾烷醇 异螺甾烷醇型甾体皂苷。讨论对胡芦巴及其盐制品的化学成分分析结果表明，胡芦巴经盐制后化学成分的含量发生变化，但机制不同。黄酮碳苷在盐制后响应升高、但在生品、盐品中均存在、并且差异性黄酮类化合物种并无炮制后响应降低的成分，提示黄酮碳苷类成分炮制后响应升高的原因为盐制使种质疏松、溶出增加。而呋甾烷醇型甾体皂苷结构不稳定，在加热过程中容易转化为螺甾烷醇型 异螺甾烷醇型甾体皂苷。因此螺甾烷醇型甾体皂苷在盐品中响应升高，而呋甾烷醇型甾体皂苷在生品中响应降低。此外，也有文献报道在胡芦巴中分离得到呋甾烷醇型甾体皂苷以及螺甾烷醇型 异螺甾烷醇型甾体皂苷，表明药学研究 .1，.1表 胡芦巴及其盐制品之间的差异性成分编号化合物名称保留时间 实测值（）碎片离子（）分子式偏差 值盐制后含量变化趋势，升高 （，）（），升高（）（），升高 （），升高 （），升高 （），升高 （），升高 （），升高 ，降低 ，降低 ，降低，降低 ，降低 ，降低，降低 ，升高，升高 ，升高，升高，升高，升高，升高 ，升高，升高升高这一转化过程既可能发生在炮制过程中，也可能发生在对生品药材的提取过程中。本试验采用的样品为甲醇超声提取获得，采用 分析生品样品中含有多种呋甾烷醇型甾体皂苷，而这些皂苷在盐制后响应降低，提示在本试验条件下观察得到的甾体皂苷含量及种类的变化是由炮制导致的。参考文献：国家药典委员会中华人民共和国药典 年版（一部）北京：中国医药科技出版社，：姜明月，叶斌斌，曲扬，等胡芦巴生制品降血脂功效研究药学研究，（）：何彦峰，马宏婷，王瑞楠，等胡芦巴化学成分和药理活性研究进展中国中药杂志，（）：姜明月，曲扬，鞠成国，等响应面法优化盐胡芦巴炮制工艺中南药学，（）：王雅莉，胡光，张倩，等炮制对中药的化学成分及药理作用的影响 重庆理工大学学报（自然科学），药学研究 .1，.1，（）：颜翠萍，吴育，翁泽斌，等盐制对补骨脂中主要化学成分的影响中成药，（）：季德，苏晓楠，黄紫炎，等 法测定知母盐炙前后 种成分量变化中草药，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：郭信东，梁军，宫凤秋，等知母呋甾烷醇型皂苷的质谱裂解行为研究中医药学报，（）：，（）：，（）：，（）：（上接第 页）结果，故得出的结论仍需进一步以实验为基础加以验证，以更加准确地揭示中药络石藤治疗 的具体作用机制。参考文献：姚茹冰，彭浩，蔡孟成，等基于网络药理学的青风藤治疗类风湿关节炎的作用机制研究药学实践杂志，（）：凌益，徐晖，黄颖，等基于网络药理学探讨青风藤治疗类风湿关节炎的作用机制中药材，（）：唐王冰注黄帝内经素问郝胜利，李丽编辑北京：人民卫生出版社，太平惠民和剂局太平惠民和剂局方北京：中国中医药出版社，：国家药典委员会中华人民共和国药典 年版（四部）北京：中国医药科技出版社，：李时珍本草纲目：版北京：华夏出版社，：，（）：徐强，李海燕，金刚木犀草素抗骨性关节炎潜在靶点的筛选与鉴定 浙江中医药大学学报，（）：，（）：陈元堃，曾奥，罗振辉，等谷甾醇药理作用研究进展广东药科大学学报，（）：，（）：曾莉萍，徐贤柱，饶华，等杜仲叶 谷甾醇对成骨细胞和卵巢颗粒细胞的影响时珍国医国药，（）：徐碧云 抑制剂的研究进展中国现代应用药学，（）：，：，（）：刘琼，李永乐，董平，等 信号通路与类风湿关节炎相关性探讨 风湿病与关节炎，（）：，（）：药学研究 .1，.1