lncRNA_NBAT1通...响肝癌细胞增殖和转移的机制_潘剑辉.pdf

lncNA NBAT1 通过 MAPK 通路影响肝癌细胞增殖和转移的机制潘剑辉1苏子剑2林春城2潘群雄2(1 福建省立金山医院(福建省立医院南院)普外科，福建福州350001;2 福建医科大学附属泉州市第一医院肝胆外科)摘要 目的探讨 lncNA 神经母细胞瘤相关转录物(NBAT)1 对肝癌细胞增殖和转移的影响及分子机制。方法取 43 例肝癌组织及癌旁组织，用实时荧光定量聚合酶链反应(T-qPC)检测 lncNA NBAT1 表达水平;将肝癌细胞 MH-CC97H 分为 pcDNA 组(转染 NBAT1 过表达载体质粒的阴性对照)、pcDNA-NBAT1 组(转染 NBAT1 过表达载体质粒)、SB203580 组 10 mol/L 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂 SB203580、Con 组(不进行任何处理);四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;划痕实验检测细胞划痕愈合率;Transwell 检测侵袭细胞数;Western 印迹检测蛋白表达。结果肝癌组织中 lncNA NBAT1 的表达水平显著低于癌旁组织(P0.05)。过表达 ln-cNA NBAT1 后，肝癌细胞 MHCC97H 活性降低，肝癌细胞克隆形成数减少，划痕愈合率降低，侵袭肝癌细胞数减少，p-细胞外信号调节激酶(EK)、p-p38 和磷酸化 c-Jun NH2-末端激酶(p-JNK)蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(均 P0.05)。MAPK 通路抑制剂 SB203580 对肝癌细胞的作用与过表达 lncNA NBAT1 相同。结论过表达 lncNA NBAT1 可能通过抑制MAPK 通路抑制肝癌增殖和转移。关键词 lncNA 神经母细胞瘤相关转录物(NBAT)1;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路;肝癌;增殖;转移中图分类号 735.7 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0671-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.042基金项目:泉州市科技高层次人才计划项目(2019C032)第一作者:潘剑辉(1992-)，男，硕士，住院医师，主要从事肝胆外科疾病研究。肝癌具有高侵袭性、易转移的特点，病死率高、预后差1。肝癌的发生和发展是一个多因素参与、多途径形成的复杂病理过程，涉及多基因与多通路。虽然目前对肝癌的诊断及治疗有了很大的成效，但是对其发生发展的病理机制仍认识不足，因此探索新的肝癌相关生物学标志物对于肝癌的早期诊断及治疗和预后至关重要2，3。研究表明，一些 lncNA在肝癌组织中表达失控，与肝癌的发生、发展、转移关系密切，有望成为肝癌新的预防、治疗和预后的指标4。神经母细胞瘤相关转录物(NBAT)1 是新鉴定的功能性 lncNA，在多种癌症中起肿瘤抑制剂作用;如 NBAT1 在胃癌组织中下调表达，其低表达与肿瘤分期和淋巴结转移及预后不良有关;过表达NBAT1 抑制了胃癌的增殖、迁移和侵袭5。NBAT1在神经胶质瘤组织中也低表达，NBAT1 过表达通过mi21/Y 性别决定基因(SOX)7 轴抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭6。NBAT1 通过 mi-21-5p/细胞因子转导信号抑制因子(SOCS)6 轴抑制膀胱癌的恶性细胞表型7。然而 NBAT1 在肝癌中的作用及机制尚不清楚。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在细胞的生长发育过程中起重要作用，主要包括细胞外信号调节激酶(EK)途径、c-Jun NH2-末端激酶(JNK)及p38MAPK 途径，MAPK 信号通路通过一系列酶的激活与失活调节细胞内反应，影响肿瘤的生长和转移;且研究发现 MAPK 通路与肝细胞癌的发生、发展有关8，9。研究报道10，LINC00601 上调通过激活MAPK 信号通路促进肝癌的发展10。LINC00844通过靶向锌结合 A2-糖蛋白(AZGP)1 抑制 MAPK信号传导，从而抑制肝细胞癌的进展11。然而 ln-cNA NBAT1 是否通过 MAPK 信号通路影响肝癌进展尚不清楚，本研究旨在探讨 lncNA NBAT1 是否通过 MAPK 信号通路影响肝癌进展。1材料与方法1.1材料收集泉州市第一医院收治的 43 例肝癌患者癌组织及癌旁组织，手术切除的组织标本立即用液氮保存，所有患者知情且同意。1.2主要试剂肝癌细胞株 MHCC97H 购自美国ATCC;PMI1640 培养基购自美国 Hyclone 公司;MAPK 通路抑制剂 SB203580 购自北京百奥莱博科技有限公司;Trizol 试剂购自南京森贝伽生物科技有限公司;荧光定量试剂盒购自日本 TaKaa 公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国 Sciencell 公司;Transwell 小室、基质胶购自美国 Corning 公司;蛋白提取试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司;p-EK、p-p38 和 p-JNK 抗体购自美国 Santa Cruz 公司。176潘剑辉等lncNA NBAT1 通过 MAPK 通路影响肝癌细胞增殖和转移的机制第 3 期1.3细胞处理与分组肝癌细胞株 MHCC97H 用PMI1640 培养基培养，将 NBAT1 过表达载体及阴性对照质粒转染至 MHCC97H 细胞中，记为 pcDNA-NBAT1 组、pcDNA 组;将 10 mol/L MAPK 通路抑制 剂 SB203580处 理 MHCC97H 细 胞，记 为SB203580 组，正常培养的细胞记为 Con 组。1.4实时荧光定量聚合酶链反应(T-qPC)检测lncNA NBAT1 的表达水平各取 5 g 肝癌组织及癌旁组织，加入 Trizol 试剂提取其总 NA，同时用Trizol 试剂提取细胞 pcDNA 组、pcDNA-NBAT1 组细胞的总 NA，反转录成 cDNA，按试剂盒说明进行PC，反应条件为 95 2 min，95 15 s，60 30 s，40 个循环;相对表达量用 2Ct法计算。lncNANBAT1 上游引物:5-ATTTCTGCTCCTGGGTCTTAC-3，下游:5-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3;GAP-DH 上游引物:5-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3，下游:5-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3。1.5MTT 检测细胞增殖细胞培养 48 h，加入20 l的 MTT 溶液，培养 4 h 后加入二甲基亚砜(DMSO)150 l，振荡反应 10 min，酶标仪检测450 nm处吸光度(OD)值。1.6克隆形成实验检测细胞克隆形成数取 pcD-NA 组、pcDNA-NBAT1 组、SB203580 组、Con 组对数生长期细胞，制成细胞悬液，接种于 6 孔板中，每组设 3 个复孔，培养 2 w 出现肉眼可见克隆时终止培养，然后用吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数50 个细胞的集落。1.7划痕实验检测细胞划痕愈合率pcDNA 组、pcDNA-NBAT1 组、SB203580 组、Con 组细胞消化后接种在培养皿中培养，在盘底用记号笔划线做标记，过夜细胞铺满后用枪头垂直横线划痕，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗划下的细胞，换液后继续培养，在培养 0 h 和 48 h 后拍照观察，用 Image-Pro Plus6.0 软件计算划痕愈合率。1.8Transwell 检测侵袭细胞数将 pcDNA 组、pcDNA-NBAT1 组、SB203580 组、Con 组细胞在无血清的培养液中饥饿12 h，调整细胞浓度为5105个/ml;用基质胶包被 Transwell 小室底部膜的上室，取100 l细胞悬液加入 Transwell 小室，培养24 h，取出Transwell 小室，弃去培养液后用 PBS 洗 2 遍，甲醇固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS 洗 3 遍，用显微镜随机选取 5 个视野观察计数细胞。1.9Western 印迹检测蛋白表达提取细胞总蛋白，定量后取 50 l 蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用 5%的牛血清蛋白封闭1 h，然后加入一抗 4 过夜，洗膜后再加入二抗室温培养 1 h，洗膜后加入化学发光试剂显影，成像后用ImageJ 软件分析蛋白条带的灰度水平，计算蛋白表达水平。1.10统计学分析采用 SPSS20.0 软件进行 t检验。2结果2.1lncNA NBAT1 在肝癌组织中表达肝癌组织中 lncNA NBAT1 表达水平(0.350.04)显著低于癌旁组织(1.000.09;t=43.277，P=0.000)。2.2过表达 lncNA NBAT1 对肝癌 MHCC97H 细胞增殖的影响与 pcDNA 组比较，pcDNA-NBAT1组肝癌 MHCC97H 细胞中 lncNA NBAT1 表达水平明显升高，肝癌细胞活性明显降低，肝癌细胞克隆形成数明显减少(P0.05)，见图 1、表 1。图 1过表达 lncNA NBAT1 对肝癌MHCC97H 细胞克隆形成的影响(结晶紫染色)表 1过表达 lncNA NBAT1 对肝癌 MHCC97H 细胞增殖及转移影响(xs，n=9)组别lncNA NBAT1OD 值(450nm)细胞克隆形成(个)划痕愈合率(%)侵袭细胞数(个)pcDNA 组1.000.070.720.05120.7813.7371.187.04107.6911.43pcDNA-NBAT1 组3.040.220.330.0360.336.5333.743.9847.694.62t/P 值26.509/0.00020.065/0.00011.928/0.00013.889/0.00014.600/0.0002.3过表达 lncNA NBAT1 对肝癌 MHCC97H 细胞转移的影响与 pcDNA 组比较，pcDNA-NBAT1276中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷组肝癌 MHCC97H 细胞的划痕愈合率明显降低，侵袭肝癌细胞数明显减少(P0.05)。见表 1、图 2。图 2过表达 lncNA NBAT1 对肝癌 MHCC97H细胞迁移及侵袭(结晶紫染色，200)的影响2.4过表达 lncNA NBAT1 对肝癌 MHCC97H 细胞MAPK 通路的影响与 pcDNA 组比较，pcDNA-NBAT1组肝癌 MHCC97H 细胞中 p-EK、p-p38 和 p-JNK 蛋白表达水平明显降低(P0.05)，见图3、表2。1 2:pcDNA 组，pcDNA-NBAT1 组图 3两组 MAPK 通路相关蛋白表达2.5MAPK 通路抑制剂(SB203580)对肝癌 MH-CC97H 细胞增殖和转移的影响与 Con 组比较，SB203580 组肝癌 MHCC97H 细胞中 p-EK、p-p38和 p-JNK 蛋白表达水平明显降低，肝癌细胞活性明显降低，肝癌细胞克隆形成数明显减少，细胞划痕愈合率明显降低，侵袭细胞数明显减少(P0.05)。见图 4、图 5、表 3、图 6。表 2过表达 lncNA NBAT1 对肝癌 MHCC97H 细胞 MAPK 通路的影响(xs，n=9)组别EKp-EKp38p-p38JNKp-JNKpcDNA 组0.910.070.720.050.640.060.470.040.570.050.370.03pcDNA-NBAT1 组0.930.080.290.030.660.040.170.020.550.040.110.02t/P 值0.564/0.58022.123/0.0000.832/0.41820.125/0.0000.937/0.36321.633/0.000图 4两组信号通路相关蛋白表达图 5MAPK 通路抑制剂对肝癌MHCC97H 细胞克隆形成的影响(结晶紫染色)376潘剑辉等lncNA NBAT1 通过 MAPK 通路影响肝癌细胞增殖和转移的机制第 3 期表 3MAPK 通路抑制剂对