阿克替苷通过调控ERK1_...路抑制肝癌细胞上皮间质转化_袁倩倩.pdf

肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 CancerResPrevTreat,2023,Vol.50,No.112doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2023.22.0535阿克替苷通过调控ERK1/2信号通路抑制 肝癌细胞上皮间质转化袁倩倩，何昱静，温雪，张久聪，郑英，卢利霞，李斌，于晓辉Acteoside Inhibits Epithelial Mesenchymal Transformation of Hepatoma Cells Through Regulation of ERK1/2 Signaling PathwayYUANQianqian,HEYujing,WENXue,ZHANGJiucong,ZHENGYing,LULixia,LIBin,YUXiaohuiDepartment of Gastroenterology,The 940th Hospital of Joint Service Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army,Lanzhou 730050,ChinaCorresponding Author:YU Xiaohui,E-mail:Abstract:Objective Toinvestigatetheeffectandmechanismofacteoside(ACT)ininhibitingepithelial-mesenchymaltransition(EMT)inhumanhepatomaHCCLM3cellsbyregulatingtheERK1/2pathway.Methods CCK-8assaywasusedtodetecttheeffectofhepatocellularcarcinomacellproliferation.TheinvasionandmigrationofHCCcellsweredetectedbyscratchandTranswelltests.ThemRNAandproteinexpressionlevelsoftheERK1/2signalingpathwayandEMT-relatedgenes(E-cadherinandN-cadherin)weredetectedbyreal-timePCRandWesternblotanalyses.Results ACTreducedtheactivityofHCCLM3cellsandinhibitedtheproliferationofHCCcells,andtheeffectshadcertaincorrelationwithdrugconcentrationandtime.ACTinhibitedthemigrationandinvasionprocessofHCCLM3cellsinaconcentration-dependentmanner.ACTdownregulatedthemRNAandproteinexpressionofgenesrelatedtotheERK1/2signalingpathway.ItincreasedthemRNAandproteinexpressionlevelsoftheEMT-relatedgeneE-cadherinbutdecreasedthoseofN-cadherin.Conclusion ACTcouldinhibitEMTandtheinvasionandmigrationofHCCLM3cellsinhumanhepatoma,andtheunderlyingmechanismiscloselyrelatedtothedownregulationoftheERK1/2signalingpathway.Key words:Acteoside;HCCLM3cells;ERK1/2signalingpathway;Epithelialmesenchymaltransformation;Invasion;MigrationFunding:GansuProvincialScienceandTechnologyDepartmentSocialDevelopmentDepartmentClinicalMedicalResearchCenterProject(No.21JR7RA017;No.20JR10RA017)Competing interests:Theauthorsdeclarethattheyhavenocompetinginterests.摘 要：目的 探讨阿克替苷（ACT）通过调控ERK1/2通路抑制人肝癌HCCLM3细胞上皮间质转化（EMT）的作用及其机制。方法 CCK-8法检测肝癌细胞的增殖能力；划痕实验和Transwell实验检测肝癌细胞侵袭及迁移能力；实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测ACT对ERK1/2信号通路和上皮间质转化相关基因（E-cadherin、N-cadherin）mRNA和蛋白的表达。结果 CCK-8法检测结果显示，ACT可降低肝癌HCCLM3细胞的活性，抑制肝癌细胞的增殖能力，并与药物浓度和时间有一定的相关性。划痕实验和Transwell实验结果显示，ACT能抑制肝癌HCCLM3细胞迁移和侵袭能力，并呈浓度依赖性。荧光定量PCR和蛋白质印迹实验表明，ACT可下调ERK1/2信号通路相关基因mRNA和蛋白的表达，上调EMT相关基因E-cadherinmRNA和蛋白的表达，下调N-cadherinmRNA和蛋白的表达。结论 ACT可抑制人肝癌HCCLM3细胞EMT、侵袭及迁移，其作用机制与下调ERK1/2信号通路密切相关。关键词：阿克替苷；HCCLM3细胞；ERK1/2信号通路；上皮间质转化；侵袭；迁移中图分类号：R735.7 开放科学(资源服务)标识码(OSID)：收稿日期：2022-05-17；修回日期：2022-11-22基金项目：甘肃省科技厅社发处临床医学研究中心项目（21JR7RA017;20JR10RA017）作者单位：730050兰州，中国人民解放军联勤保障部队第九四医院消化科通信作者：于晓辉（1965-），女，博士，主任医师，主要从事肝病诊治及肝癌治疗，E-mail:作者简介：袁倩倩（1993-），女，硕士，住院医师，主要从事中草药化合物在肝癌细胞中的作用机制研究基础研究0 引言肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是全球危害人类健康常见的恶性肿瘤之一。由于肿瘤复杂的发病机制和异质性，就诊时多数已发生肝内外转移，预后较差。阿克替苷（acteoside,ACT），是一种水溶性的苯丙素苷类化合物，具有抗氧化1、抗炎2、抗菌3、抗动脉粥样硬化4、肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 CancerResPrevTreat,2023,Vol.50,No.113抗肿瘤5等多种药理活性。ACT在肝癌细胞中的具体作用和机制尚无更深入的研究。上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransi-tions,EMT）作为恶性肿瘤侵袭和转移的第一步，是一个动态、可逆的过程，而抑制EMT发生可作为抑制肿瘤侵袭及转移的一种重要手段。恶性肿瘤的发生和发展与细胞信号转导通路的异常调控有关6。细胞外信号调节激酶1/2（extracellularsignalregulatedkinase1/2,ERK1/2）作为MAPK信号通路的亚通路在肝癌细胞的EMT、侵袭及迁移过程中发挥重要作用7。目前尚未见有关ACT通过ERK1/2信号通路影响肝癌细胞EMT的具体作用和机制的研究报道。因此，本实验拟初步探讨ERK1/2信号通路在肝癌细胞中的表达，并通过细胞学实验探讨中草药化合物ACT与肝癌生物学机制的相关性，为ACT治疗肝癌提供实验依据和理论基础。1 材料与方法1.1 细胞株和试剂人肝癌HCCLM3细胞（中国上海科学院上海细胞库）；ACT（南京景竹生物科技有限公司）；高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白、CCK-8试剂（均购自美国Gibco公司）；胎牛血清（美国沃卡威生物技术有限公司）；PBS（美国Lab-conco公司）；无血清冻存液（英国Whatman公司）；0.1%结晶紫（北京索莱宝生物科技有限公司）；ERK1/2抑制剂PD98059、SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、EvoM-MLV反转录试剂预混液、SYBRGreenPremixProTaqHSqPCRKit（均购自美国MedChemExpress公司）；5蛋白上样缓冲液、RIPA强裂解液、PMSF裂解液、10%SDS、Tris-HCL缓冲液、PAGE胶凝固剂、促凝剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECLPlus化学发光显色液（均购自北京Solarbio科技有限公司）；E-cadherin抗体（ab231303）、N-cadherin抗体（ab76011）（均购自英国Abcam公司）；ERK1/2抗体（AF0155）、p-ERK1/2抗体（AF1015）、Betaactin抗体（AF7018）、辣根酶标记酶山羊抗兔IgG（S0001）（均购自美国Affinity公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养 肝癌HCCLM3细胞用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素双抗（1105u/L）的高糖DMEM培养液，常规复苏细胞后，置于37、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行细胞换液、传代、冻存或用于后续实验。1.2.2 CCK-8法检测细胞的增殖 按药物浓度设置5组（0、40、80、120、160mol/L），取对数生长期的肝癌HCCLM3细胞，各组按5103个细胞/孔接种于3个96孔板，每组设置5个复孔，细胞培养板置于培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，加入上述不同浓度的ACT药物，分别继续培养24、48、72h后，每孔加入10lCCK-8溶液培养30min，酶标仪检测450nm波长处各孔吸光度（OD）值，分析细胞的增殖能力，根据OD值计算细胞抑制率，并筛选出最佳抑制浓度和时间。细胞抑制率=（对照组OD值实验组OD值）/（对照组OD值空白组OD值）100%。1.2.3 划痕实验检测细胞的运动能力 在铺板前用Marker笔在6孔板背面均匀划横线，每孔35条。将肝癌HCCLM3细胞按5105个/孔接种于培养板中，每组设置3个复孔，置于37、5%CO2恒温培养箱中，待75%85%细胞贴壁后用10l枪头垂直划痕。磷酸盐缓冲溶液PBS洗细胞3次，加入不同浓度ACT。分别在0、12、24h后每孔选取5个视野在显微镜下拍照记录。1.2.4 Transwell实验检测肝癌细胞侵袭及迁移实验 在4条件下将基质胶按1:8稀释，吸取60l包被Transwell小室上室面，置于培养箱使基质胶聚合成凝胶。取对数生长期的细胞，细胞贴壁后加入不同浓度的ACT处理24h。制备细胞悬液，用无血清培养基重悬细胞。计数并调整细胞密度为（11041105）个/毫升。吸取200l细胞悬液加入小室。24孔板下室加入600l含20%血清的培养基，培养24h。取出小室，放入烧杯中PBS洗2遍，95%乙醇固定30min。用0.1%结晶紫染色30min，PBS清洗3遍。放置在显微镜下观察，分别选取五个视野，用ImageJ软件计数穿过小室的肝癌细胞数。迁移实验在小室底部膜的上室不铺胶，其余步骤同侵袭实验。实验重复3次。1.2.5 实时定量PCR检测ACT对ERK1/2信号通路和EMT相关基因mRNA的表达 不同浓度的ACT处理细胞24h，按照SteadyPure通用型RNA提取试剂盒说明书进行操作，分别提取细胞的总RNA，荧光定量PCR仪检测ERK1/2信号通路和EMT相关基因在mRNA水平的表达量。ERK1基因上游引物序列为5-TCAACACCACCTGCGACCT-3，下游为5-CGTAGCCACCTGCGACCT-3；ERK2基因上游引物为5-TGG