NaCl对箭筈豌豆主要贮藏蛋白界面性质的影响_王宇慧.pdf

NaCl 对箭筈豌豆主要贮藏蛋白界面性质的影响草学CAOXUENaCl 对箭筈豌豆主要贮藏蛋白界面性质的影响王宇慧，张金凤，张敬，刘全兰*(青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛266045)摘要:为了探究箭筈豌豆蛋白在食品添加剂中的应用潜力，试验研究箭筈豌豆种子主要贮藏蛋白(白蛋白，common vetchalbumin protein，CVAP;球蛋白，common vetch globulin protein，CVGP)在 pH 值为 7.0 时，不同 NaCl 浓度下的界面性质。结果表明，NaCl 浓度对蛋白组分没有明显影响，CVAP 在 0.1mol/L 的离子强度下有好的界面性质，CVGP 在 0.1mol/L 的离子强度下有好的界面性质。因此，CVAP 更加具有作为烘焙食品添加剂的潜力。关键词:箭筈豌豆贮藏蛋白;NaCl;溶解度;乳化性质;起泡性质中图分类号:S542.034文献标识码:A文章编号:20963971(2023)01002706DOI:10.3969/j.issn.20963971.2023.01.005收稿日期:20221118基金项目:青岛西海岸新区 2021 年科技计划专项科技攻关“揭榜制”高效生态农业项目(项目编号 202122)资助作者简介:王宇慧(1998)，女，硕士研究生，研究方向为植物蛋白的加工与利用。*通讯作者:刘全兰(1974)，女，博士，副教授，研究方向为植物蛋白的加工与利用。箭筈豌豆(Vicia sativa L)是一年生或越年生豆科植物，在我国甘肃、青海、四川、云南、陕西、西藏、江西、江苏、山东等各省份都有种植。箭筈豌豆具有产草量大、茎叶柔嫩、粗蛋白含量高、营养丰富和适口性好等特点，是动物喜食的饲草。它的主根肥大，根瘤多，入土不深，是一种优良的绿肥植 物。箭 筈 豌 豆 每 667m2产 草 量 在 2 000 3 000kg，每 667m2种子产量在 150kg 左右1。箭筈豌豆种子含有大量的蛋白，但目前箭筈豌豆种子蛋白利用率低，其研究主要集中在作为动物饲料方面，而在人类饮食中的研究较少，这主要是由于对箭筈豌豆蛋白的相关研究较少，还没形成产业链条。箭筈豌豆种子中主要贮藏蛋白质是白蛋白(commonvetch albumin protein，CVAP)和球蛋白(commonvetch globulin protein，CVGP)，它们具有优良的起泡性和乳化性，是潜在的食品乳化剂和起泡剂2。箭筈豌豆蛋白的进一步研究将有利于它在相关领域开发出相应的具有功能特性的产品。食品乳化剂和起泡剂常需要植物蛋白在中性 pH 和低离子强度下发挥作用。如，用于蛋糕的植物蛋白需要其在中性(pH7.0)且低盐的条件下具有良好的起泡性和乳化性，用于沙拉酱的植物蛋白需要其在 pH 3.5 4.0、离子强度为4%的条件下具有良好的乳化性3。NaCl 在植物蛋白中有着广泛的应用，它可以改变植物蛋白的溶解性、乳化性和起泡性等。为了解箭筈豌豆种子 CVAP 和 CVGP 作为食品乳化剂和起泡剂的可能性，本实验初步研究了中性 pH 条件下不同离子强度对 CVAP 和 CVGP 界面性能的影响。本研究的主要内容为:中性条件下，不同离子强度对 CVAP 和 CVGP 结构组分的影响;在中性条件下，不同离子强度对这两种蛋白界面性质的影响。这些研究结果将为箭筈豌豆蛋白在食品添加剂领域的应用提供理论基础。72草学CAOXUE草业科学2023 年第 1 期总第 270 期1材料与方法1.1材料与试剂箭筈豌豆种子，四川省农业科学研究院提供的四川本地品种(川北箭豌);大豆油，山东鲁花集团有限公司;1.8苯胺萘磺酸盐(ANS)和甘氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司;蛋白 marker、4蛋白上样缓冲液(还原和非还原)、透析膜和考马斯亮蓝 250 购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。以上所有试剂均为分析纯。1.2实验仪器SIGMA 3K15 冷 冻 离 心 机，德 国 Sigma 公 司;FD1A50真空冷冻干燥机，上海比朗仪器有限公司;FJ200 高速分散均质机，上海标本模型厂;DYCZ24A 型双垂直电泳仪，北京六一生物科技有限公司;GelSMAT 凝胶成像系统，大龙兴创实验仪器。1.3实验方法1.3.1箭筈豌豆蛋白的制备称取一定量的箭筈豌豆种子在水中浸泡，豆子泡软后捞出，加入去离子水打浆，过滤豆浆，收集滤出溶液，磁力搅拌 4h，离心收集上清液(室温，6 000g，10min)，此时上清液中的蛋白为箭筈豌豆白蛋白(CVAP)5。离心后的沉淀与5%NaCl 混合，磁力搅拌 4h，离心收集上清液(室温，6 000g，10min)，此时上清液中的蛋白为箭筈豌豆球蛋白(CVGP)5。得到的上清液均放置在 4冰箱中冷沉过夜。CVAP 上清液用 1mol/L HCl 调节 pH 3.5 左右，CVGP 上清液调节 pH 4.5 左右，离心收集沉淀(4，8 000g，10min)，沉淀用去离子水分散为蛋白溶液，蛋白溶液用 1mol/L NaOH 调 pH 至 7.0，倒入透析袋中，透析 48h(4)，冷冻干燥，干燥后的蛋白样品置于 4冰箱中冷藏备用。1.3.2不同离子强度盐溶液处理箭筈豌豆蛋白取 100mg 干燥后的箭筈豌豆蛋白，加入 10mL 的去离子水，涡旋振荡 10min，得到 1%(w/v)的箭筈豌豆蛋白溶液(pH 7.0)。蛋白溶液中加入 NaCl溶液分别配成浓度梯度为 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L 的蛋白浓度。CVAP 在上述离子强度下性质变化不明显，又配制了浓度梯度较小(0.02、0.04、0.05、0.06、0.08mol/L)的蛋白溶液进行性质测定。配好的蛋白溶液在 25磁力搅拌 2h 后，在室温下 8 000g 离心10min，取上清液备用。1.3.3箭筈豌豆蛋白组分分析箭筈豌豆蛋白组分采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylam-ide gel electrophoresis，SDSPAGE)的方法进行分析6。按 1 2 的体积比，蛋白溶液分别与还原和非还原上样缓冲液混合，煮沸 5min 后离心。各样品按顺序点样，在 12%的分离胶(120V)和 5%的浓缩胶(80V)的条件下进行电泳，0.1%的考马斯亮蓝250 染 色，脱 色 液 脱 色 至 背 景 色 基 本 消 失，GelSMAT 拍照分析。1.3.4溶解度的测定考马斯亮蓝法测定不同 NaCl 强度下的蛋白上清液中可溶性蛋白的含量7。溶解度的计算公式为:溶解度(%)=上清液中蛋白质的质量总蛋白质量100(1)1.3.5乳化性及乳化稳定性的测定取不同离子强度下的蛋白溶液，按 2 1 的比例(v:v)加 入 大 豆 油，乳 化(20000rpm，2min)，分别在 0min 和 30min 时测定乳液中乳化层的吸光度7。具体方法如下:取 25L 乳化层的蛋 白 溶 液 加 入 到 试 管 中，再 加 入 5mL 0.1%SDS 溶液，在 500nm 处测定其吸光度值。乳化性的计算公式为:乳化活性(EAI)(m2/g)=22.303A0DC10000(2)乳化稳定性(ESI)(min)=A0A0A1t(3)式中:C 为蛋白质初始浓度;为光路，1cm;为油体积分数，0.25;D 为稀释系数，200;A0和A1是 0min 和 30min 的吸光度。1.3.6起泡性及起泡稳定性的测定取不同离子强度下的蛋白溶液(10mL)，用均质机以 20 000rpm 均质 4min，分别记录 0min 和82NaCl 对箭筈豌豆主要贮藏蛋白界面性质的影响草学CAOXUE30min 时的泡沫体积7。起泡性的计算公式为:起泡能力(FC)(%)=V0V100(4)起泡稳定性(FS)(%)=V1V0100(5)式中:V 为原始溶液体积;V0为 0min 蛋白溶液体积;V1为 30min 蛋白溶液体积。1.3.7数据处理使用 Origin2018 和 SPSS 软件进行数据的统计分析。2结果与分析2.1离子强度对 CVAP 和 CVGP 蛋白组分的影响为了探究中性条件下离子强度对蛋白质分子量组成的影响，采用SDSPAGE 在还原和非还原条件下进行电泳分析CVAP 和CVGP 的组分变化。已有研究表明 CVAP的主要组成成分为7S，还含有少量的11S 亚基;CVGP 的主要组成成分为7S，还含有少量的11S 亚基 2。CVAP 和 CVGP 随离子强度变化发生的组分变化如图 1 所示。由图 1A 发现，不同离子强度的 CVAP在非还原条件下的主要条带出现在 43.0 66.2kDa 之间，还有少量条带位于 22.0kDa 和 31.0 43.0kDa 之间;由图 1B 发现，不同离子强度的 CVAP 在还原条件下的主条带分别出现在 22.0kDa、31.0 43.0kDa和 43.0 66.2kDa 之 间，与 非 还 原 条 件 相 比，22.0kDa 和 31.0 43.0kDa 之间的条带颜色加深，而43.0 66.2kDa 之间的条带颜色变浅，这说明在此处11S 亚基的二硫键被打开，可见，离子强度没有明显的改变 CVAP 组分:其主要组成成分仍为7S 蛋白，还伴有少量的11S 蛋白。由图1C 发现，非还原条件下球蛋白的条带均出现在 43.0 66.2kDa 之间，而由图1D 发现，在还原条件下球蛋白 43.0 66.2kDa 之间的条带颜色变浅，并且在 22.0kDa 和 31.0 43.0kDa之间出现了明显条带，这是由于 43.0 66.2kDa 之间存在由二硫键连接的蛋白分子，可见，离子强度也没有明显改变 CVGP 的组分:其主要组成成分仍为 11S蛋白，还伴有少量的 7S 蛋白。SDSPAGE 中蛋白条带颜色有差异，CVAP 在离子强度为 0 时条带颜色最深，随着离子强度增加，其条带颜色逐渐变浅;CVGP 在 0.1mol/L 处的条带颜色最浅，而在 0.6mol/L 处的条带颜色最深，这说明离子强度影响了蛋白的溶解度，与其溶解度变化趋势相一致(见图 2)。图 1不同离子强度下 CVAP 和 CVGP 的蛋白组成注:m 为 marker，泳道1 11 分别对应离子强度 0.0 1.0mol/L(0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L)，A 和 B 分别对应 CVAP 在非还原与还原条件下的 SDSPAGE，C 和 D 分别对应 CVGP 在非还原与还原条件下的 SDSPAGE。92草学CAOXUE草业科学2023 年第 1 期总第 270 期图 2不同离子强度下 CVAP(A)和 CVGP(B)溶解度2.2离子强度对箭筈豌豆 CVAP 和 CVGP 溶解性的影响中性条件下，不同离子强度对箭筈豌豆 CVAP和 CVGP 溶解度的影响如图 2 所示。从图 2A 可以看出，当离子强度由 0 增加到 0.08mol/L 时，CVAP 的溶解度增加，并在 0.08mol/L 达到最大值 41.72%;离子强度增加到 0.3mol/L 时，其溶解度剧烈下降，并在 0.3mol/L 达到最小值 23.81%;随着离子强度继续增加，其溶解度稍有增加，但其增加程度较小，趋势较为平缓。从图 2B 可以看出，CVGP 溶解度呈现出先下降后上升再下降的趋势，在离子强度为0.1mol/L 达 到 其 溶 解 度 最 小 值 20.96%，而 在0.6mol/L 达到最大值 42.31%。箭筈 豌 豆 CVAP 的 溶 解 度 在 低 离 子 强 度(0.08mol/L)表现出盐溶现象，而后表现出盐析现象，这与大豆分离蛋白8 的结果相一致。而 CVGP的溶解度在低离子强度(0 0.1mol/L)表现出盐析现象，随着离子强度的增加，表现出盐溶现象，这与燕麦分离蛋白9 的结果