2-(2-氨基苯基)苯并咪...及其与BSA作用的光谱研究_袁涛.pdf

化学试剂 第 卷第 期（氨基苯基）苯并咪唑铂（）配合物的合成及其与 作用的光谱研究袁涛，覃姣兰，罗翠萍，仇继家，钟雨佳，姚鹏飞（百色学院 化学与环境工程学院 广西城市水环境重点实验室，广西 百色）摘要：以（氨基苯基）苯并咪唑（）和 为原料反应合成铂配合物（）（），并获得其晶体结构。在生理条件下（.），利用紫外吸收光谱、荧光光谱研究 和 对牛血清白蛋白（）相互作用的影响。结果表明，和 通过静态猝灭方式引起 荧光发生猝灭，在、这 个温度下，对 的猝灭率及猝灭常数均大于。焓变（）、熵变（）和吉布斯自由能变化（）表明，与 间的作用力主要是疏水力（、），结合是自发进行的（）；而 与 间的作用力主要是氢键和范德华力（、），结合也是自发进行的（）。紫外可见吸收光谱和同步荧光光谱表明 并未使 的微结构发生改变。关键词：铂配合物；牛血清白蛋白；荧光光谱；相互作用；静态猝灭中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：（），（，）：（）（）（）（）（），（.），（）（）（）（，），（）（，），（）：；收稿日期：；网络首发日期：基金项目：广西省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室开放课题项目（）；国家级大学生创新创业训练计划项目（，教高司函 号，）。作者简介：袁涛（），男，山东菏泽人，硕士，讲师，主要研究方向为配合物的合成及活性研究。通讯作者：覃姣兰，：。引用本文：袁涛，覃姣兰，罗翠萍，等（氨基苯基）苯并咪唑铂（）配合物的合成及其与 作用的光谱研究化学试剂，（）：。苯并咪唑基团同时含有芳香环和咪唑环，含有苯 并 咪 唑 基 团 的 衍 生 物 表 现 出 具 有 抗 肿瘤，、抗炎、抗菌和抗氧化等生物活性，因此该类基团被广泛用到药物设计中，如临床用于治疗胃部疾病的药物雷贝拉唑钠（）和奥美拉唑（）。以苯并咪唑基团为骨架，在不同位置引入功能基团获得效果显著、靶点多样的抗肿瘤化合物，如已经上市的烷化剂苯达莫司汀（）和进入期临床试验的蛋白酪氨酸激酶（，）抑制剂（），均是在，位引入双取代基。苯并咪唑基团具有较好的共轭结构，咪唑环上的两个 原子有孤对电子，活性较高，是良好配体，易与生物体中的各类酶或受体形成氢键，或是与金属离子配位形成配合物，充分发挥了“苯并咪唑基团中心金属离子”双活第 卷第 期袁涛等：（氨基苯基）苯并咪唑铂（）配合物的合成及其与 作用的光谱研究性功能。比如，苯并咪唑及其衍生物易与铜，、银等过渡金属离子还有铕、铽、钐等稀土离子配位，均获得抗肿瘤活性比相应配体好的金属配合物。在抗癌金属配合物中，铂类药物是研究热点，继顺铂、卡铂、奥沙利铂、萘达铂等的临床应用后，近年来人们设计合成出很多创新型的铂类抗癌药物，并对其作用机制进行了深入研究，为癌症治疗提供了许多的方法策略，对癌症的治疗具有重要意义。铂与苯并咪唑类化合物的协同作用也表现出良好的生物活性，如 等合成了系列含苯并咪唑的（）配合物，如 氯（烷基）苯并咪唑）铂（）配合物和 氯（，三甲氧基）苯并咪唑）铂（）配合物显示出比卡铂和顺铂强的 相互作用。小分子药物与蛋白质生物大分子间的相互作用一直备受关注，两者形成稳定的药物蛋白质复合物，对药物在血液和运输、分配具有重要影响。白蛋白是一种重要的储存和转运蛋白，牛血清白蛋白（）和人血清白蛋白（）具有高度相似的折叠结构，且成本低，易于获得，经常被用作模型蛋白。本文合成了（氨基苯基）苯并咪唑铂（）配合物（），研究 与 的相互作用，为铂类药物的作用机制提供科学依据。实验部分.主要仪器与试剂 型单晶 射线衍射仪（日本 公司）；型荧光分光光度计（日本日立公司）；型紫外可见分光光度计、型傅里叶变换红外分析仪（日本岛津公司）。（氨基苯基）苯并咪唑、（上海阿拉丁生化科技有限公司）；缓冲溶液（上海麦克林生化科技有限公司）；牛血清白蛋白（美国 公司）；试剂均为分析纯。.实验方法.（）的合成取.（）用 溶解，取.（）（氨基苯基）苯并咪唑（）用 甲醇溶解。将 溶液在搅拌下缓慢加入 溶液中，于 回流 ，冷却过夜，过滤，静置缓慢挥发 ，有黑色针状晶体析出，产率约为。挑选尺寸合适晶体进行射线单晶衍射测定。（），：（），（=），（苯环，取代），（）。.荧光光谱测定、分别用 溶解配成.的待测液，用 缓冲溶液（.）配成.。在 根比色管中固定 的浓度为 ，滴加.的 或，使其浓度变化范围为.，在、温度下反应 ，测其荧光光谱。激发波长为，电压 ，狭缝宽度均为 。在同步荧光中，将激发和发射波长设置为、进行测定。.测定在.（）溶液中，分别滴加浓度为.的、，使其浓度变化范围为.，反应 后，在 下进行光谱扫描。结果与讨论.晶体结构 晶体结构如图 所示，晶体学数据及结构修正参数如表 所示，部分键长、键角如表 所示。属 于 正 交 晶 系，空 间 群 为，（）与 中的一个咪唑 原子以及苯环上的氨基 原子配位，同时保留两个铂盐 原子，形成四配位结构。此外，中还含有一个结晶水分子，水分子中的氧原子与咪唑另一个 上的氢形成氢键。图 的晶体结构 化学试剂 第 卷第 期表 晶体学数据及结构修正参数 （）.（）.（）.（）.（）（）.（）.（）.（）.，.（）.，.表 的部分键长（）和键角（）（）（）化学键键长 化学键键长.（）.（）.（）.（）化学键键角（）化学键键角（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.和 对 荧光光谱的影响 中由于含有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸残基而具有较强的内源荧光，而色氨酸是 的最主要荧光来源。当小分子与 结合时，会导致 内源荧光强度降低，产生猝灭现象。图、分别是、对 荧光的影响。在 光的激发下，在 处有最大发射峰，随着 和 浓度的递增，在 的荧光强度呈现不同程度地猝灭，说明 和 可以与 结合成复合物，导致荧光猝灭。在、这 个温度下，当 时，使 荧光强度分别下降了.、.、.，且最大吸收峰发生移动（分别蓝移、）；在、这 个温度下，当 时，使 荧光强度分别下降了.、.、.，且最大吸收峰发生移动（分别蓝移、）。可见，和 均能与 相互作用，曲线 代表 浓度分别为、（）图 不同温度下 与 作用的荧光光谱图（）及 曲线（）（）（）导致 猝灭较 更显著，推测 与 作用更强。此外，与 作用的荧光光谱中，随着 浓度的增加，在 处的荧光强度逐渐增强，经验证，该处荧光是 本身产生的荧光发射峰，荧光强度随着 浓度的增加而呈现上升趋势。.荧光猝灭类型根据猝灭机制的不同，荧光猝灭分为动态猝灭和静态猝灭，静态猝灭是指在基态时的荧光体分子与 形成复合体，导致荧光强度下降，而动态猝灭则是化合物与 的激发态分子发生第 卷第 期袁涛等：（氨基苯基）苯并咪唑铂（）配合物的合成及其与 作用的光谱研究 曲线 代表 浓度分别为、（）图 不同温度下 与 作用的荧光光谱图（）及 曲线（）（）（）碰撞，其不会导致吸收光谱发生变化。为研究小分子与 相互作用的荧光猝灭机理，假设两者的相互作用机理为动态猝灭，符合 方程，见式（）。（）式中：为无猝灭剂时的荧光强度；是存在猝灭剂时的荧光强度；表示荧光猝灭速率常数，（）；表示蛋白质分子的荧光平均寿命（）；表示荧光猝灭常数，；表示加入猝灭剂的浓度，。以 对 进行线性拟合，得到不同温度下的 图，如图、所示。依据拟合后的曲线方程得出猝灭常数，进而求出猝灭速率常数，计算结果见表。与 对 的猝灭速率常数 的数量级为，均远大于猝灭剂对蛋白质（生物大分子）最大碰撞猝灭常数阈值（.（），说明、对 荧光的猝灭方式为静态猝灭。对 的猝灭常数 随着温度的升高而减小，表明 引发 猝灭机制属于典型静态猝灭。对 的猝灭常数变化没有 有规律，但总体上随着温度的升高减小，表明 引发 猝灭机制属于非典型静态猝灭，而是伴随有动态猝灭，。文献、报道，小分子引起 作用静态猝灭常数并不一定随温度的升高而减小，有时会增加或保持不变。表 和 在不同温度下对 的猝灭常数 温度 （）（）.结合常数及结合位点数的确定对于静态猝灭，符合 方程（式）：（）（）式中：为小分子与 的结合常数；为结合位点数。；图 不同温度下、与 荧光猝灭的双对数曲线图 化学试剂 第 卷第 期以（）对 作图，计算结果如表 所示。由表 的 值可知，在、时 与 作用的结合常数均比 与 的结合常数大，可见形成铂配合物后与 作用随着温度的升高结合作用力增强。根据（）对 作图计算出 和 与 的结合位点数约为。表 不同温度下、与 作用的结合常数（）和结合位点数 （）（）温度 （）.作用力类型小分子与 之间的作用力可分为疏水力、静电力、氢键和范德华力。等实验描述了化合物与蛋白质相互作用的过程中有关热力学参数的关系。当、时，体系间的作用力为疏水力；当、时，体系间的作用力为静电力；当、时，体系间的作用力为氢键和范德华力。依据 方程（公式（）和热力学公式（公式（）以及上述 值可计算 和 与 作用的热力学参数。（）（）式中：为在温度 时的结合常数；为气体常数，.（）；为吉布斯自由能变，；为反应前后的热力学焓变，；为反应前后的热力学熵变，（）；为热力学温度，。当温度变化很小时，可视为常数，以 对 作图，由截距和斜率算出 和，计算结果如表 所示。与 的热力学参数、；与 的热力学参数、。由此可以判定，与 相互作用的分子间作用力主要表现为疏水作用力，结合反应自发进行；与 相互作用的分子间作用力主要表现为氢键和范德华力，结合反应自发进行。表 不同温度下 和 与 作用的热力学参数 温度（）（）（）.、与 作用的紫外可见吸收光谱紫外可见吸收光谱是一种探索小分子与蛋白质间形成复合物的简单而有效的方法，在 处有一特征吸收峰，主要是由芳香族色氨酸（）和酪氨酸（）发生 跃迁所引起的，与氨基酸残基微环境极性有关，若吸收光谱位置出现红移，说明小分子导致 芳香族氨基酸残基的结构或周围的微环境极性增加，使得蛋白质亲水性增加，。若是吸收光谱出现蓝移，表明 色氨酸残基周围微环境的疏水性的增加。图 中随着、浓度的增加，在 处吸光度逐渐增大，但峰位置并没有观察到明显变化，说明从吸收光谱中未能观察到、对 氨基酸残基的微环境极性有明显影响。曲线 代表 或 浓度分别为、（）；图 、与 作用的紫外可见吸收光谱 ，第 卷第 期袁涛等：（氨基苯基）苯并咪唑铂（）配合物的合成及其与 作用的光谱研究.同步荧光光谱同步荧光光谱可考察小分子与 相互作用引起最大峰值位置对应的蛋白质荧光微环境变化。当发射波长与激发波长的波长差 、时，同步荧光分别呈现蛋白质中酪氨酸（）和色氨酸（）残基特征荧光。由图 可知，随着 浓度的增加，酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光强度均发生猝灭，这可能是由于高浓度药物使蛋白质分子延伸，从而减少了氨基酸之间的能量转移，降低了荧光强度。但最大发射峰并没有发生明显变化，这表示 并没有引起 微环境的明显改变，与紫外光谱结果一致。曲线 代表 浓度分别为、（）；图 与 作用的同步荧光光谱 结论本文以（氨基苯基）苯并咪唑（）为配体合成了其铂配合物（），并获得配合物单晶结构，且从分子水平上研究 和 与 的相互作用。实验表明，与 均通过静态猝灭方式使 荧光发生猝灭，对 的猝灭率和猝灭常数 均大于，说明 与 的结合作用比 强。与 作用的、，说明分子间的作用力主要是疏水力，反应自发进行；与 作用的、，表明氢键和范德华力在结合过程中起着重要作用，反应自发进行。该研究结果对苯并咪唑类铂配合物的合成及作用机制提供较好参考依据。参考文献：，：，（）：，：，：，（）：徐红慧，黄树青，陈莹雷贝拉唑钠肠溶片体外释放一致性评价安徽医药，（）：牟杰，陈宁海，裴冬生苯并咪唑衍生物的抗肿瘤活性及构效关系研究 中国医药工业杂志，（）：李森苯并咪唑喹啉基金属配合物的合成及其抗肿瘤活性研究郑州：郑州大学，原邦鹏苯并咪唑 硫脲基金属配合物的合成及抗肿瘤活性研究郑州：郑州大学，杨艳芳，林娟娟，李雪华，等，双苯并咪唑银配合物的合成、抗肿瘤活性及与 的相互作用研究化学研究与应用，（）：张晓凡含苯并咪唑基稀土配合物的设计合成其与牛血清白蛋白作用的研究 武汉：湖北大学，（）：金素星，郭子建，王晓勇靶向能量代谢的抗肿瘤金属配合物药学进展，（）：，（），：，（）化学试剂 第 卷第 期