靶向抑制表皮生长因子受体可...胞间充质转分化治疗肝纤维化_曹兴旺.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期27网络出版地址：https：/ doi：10.3969/j.issn.1674-2257.2023.01.006论著靶向抑制表皮生长因子受体可通过干扰血管内皮细胞间充质转分化治疗肝纤维化*曹兴旺1，杨思艺1，袁静簃1，郭庆1，曾韵桃1，谢成亮1，毕涛，2，魏微1，21.西南医科大学 中西医结合学院（泸州 646000）；2.国家中医临床研究基地建设单位西南医科大学附属中医医院（泸州 646000）【摘要】目的观察靶向性抑制表皮生长因子受体（EGFR）的抑制剂AZ-5104对小鼠肝纤维化症状的影响，探讨AZ-5104改善肝纤维化的作用机制。方法选用了 12只雄性C57小鼠，随机分为常规组、模型组和给药组，每组 4只。除常规组外，其余两组腹腔注射浓度为 20（0.8 g/kg）的CCl4，3 d/次，共注射 4次，同时喂养高脂饲料和含有 5蔗糖的饮用水。给药组小鼠腹腔注射AZ-5104，CCl4注射完成后次日注射药物，第 3天不做处理，重复 4次上述操作，第 4次药物注射完成后，处死小鼠取材，对小鼠肝脏进行常规病理学检测以及免疫荧光染色。结果CCl4所诱导的模型组与常规组比较，肝小叶内部结构严重损坏，周围纤维结缔组织数量明显增多，并且有大小不等的假小叶形成；给药组较模型组肝纤维化症状明显改善，肝纤维化过程中血管内皮细胞间充质转分化（EndMT）明显减弱。结论AZ-5104作为靶向性抑制EGFR的抑制剂可改善小鼠肝纤维化，其抗纤维化效果的发挥可能与抑制纤维化过程中EndMT密切相关。【关键词】表皮生长因子受体；血管内皮细胞间充质转分化；肝纤维化【中图分类号】R575.1；R575.2【文献标志码】ATargeted Inhibition of Epidermal Growth Factor Receptor Improves Hepatic Fibrosis by Interfering with Endothelial-to-Mesenchymal TransitionCao Xingwang1，Yang Siyi1，Yuan Jingyi1，Guo Qing1，Zeng Yuntao1，Xie Chengliang1，Bi Tao1，2，Wei Wei1，2.1.School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Southwest Medical University，Luzhou 646000，China；2.National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，China【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of epidermal growth factor receptor（EGFR）inhibitor AZ-5104 on hepatic fibrosis in mice and explore the mechanism of AZ-5104 in improving hepatic fibrosis.MethodsA total of 12 male C57 mice were randomly divided into normal group（n=4），model group（n=4）and administration group（n=4）.The model group and the administration group received 20（0.8 g/kg）intraperitoneal injection of carbon tetrachloride（CCl4）once every 3 days for a total of 4 times，and were fed with high-fat feed and drinking water containing 5 sucrose.The administration group was intraperitoneally injected with AZ-5104 the next day after the injection of CCl4，and no treatment was done on the third day.And the above operations were repeated 4 times.After the fourth drug injection，the mice were killed for sampling.Routine pathological examination and immunofluorescence staining were performed on the sampled mice liver.ResultsCompared with the normal group，the model group induced by CCl4 showed obvious damage of hepatic lobule structure，obvious increase of fibrous connective tissue and formation of pseudolobule of different sizes.Compared with the model group，the administration group showed significant improvement of hepatic fibrosis symptoms and decreased endothelial-to-mesenchymal transition（EndMT）during hepatic fibrosis.ConclusionAZ-5104，a targeted inhibitor of EGFR，can ameliorate liver fibrosis in mice.The antifibrotic effect of AZ-5104 may be related to its inhibition of EndMT in the process of hepatic fibrosis.【Key words】Epidermal growth factor receptor（EGFR）；Endothelial-to-mesenchymal transition（EndMT）；Hepatic fibrosis*基金项目：四川省教育厅重点项目（自然科学）（No：17ZA0451）；四川省卫生和计划生育委员会科研课题（普及应用项目）（No：16PJ532）通信作者：魏微Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期28肝纤维化是由各种慢性损伤原因导致的肝组织中细胞质外基质（extracellular matrix，ECM）过度增殖和异常沉积1。肝纤维化是肝硬化和肝癌演变过程中共有的病理变化2。在急慢性损伤因素的诱导下，受损的肝脏会有新生毛细血管形成，血管内皮细胞（endothelial cell，EC）经过生芽、迁移、增殖与基质重建过程来形成毛细血管3，是新生毛细血管产生的主要推动因子。肝脏损伤过程中，血管的生成是在刺激因子和抑制因子的调控下完成，当损伤因素持续存在时，新生血管生成的这种平衡就会被打破，使得新生血管发生病理性转变。血 管 内 皮 细 胞 间 充 质 转 分 化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）是异常新生血管的常见形式之一，EndMT主要形式包括：1）EC向肌成纤维细胞转化；2）EC的功能发生变化4-5。EndMT的促纤维化作用主要体现在：1）EC可通过EndMT直接转化为肌成纤维细胞，然后产生大量ECM，加重纤维化症状6。其中，在肾脏纤维化过程中，约有 4050的纤维组织同时表达成纤维细胞（FSP1、-SMA）和EC（CD31）标记基因7。2）由于EC的功能改变，加重了纤维化过程中的炎症反应。在这个过程中，EC分泌大量的炎症因子，导致免疫细胞浸润、局部免疫反应，进而推动纤维化进展8。EndMT过程中，多种细胞间连接分子如VE-钙黏蛋白在EC中的表达减少，增加血管通透性和渗漏，削弱血液灌流能力，从而加剧组织缺氧，导致大量细胞死亡，破坏正常器官的组织结构8-9。因此，研究EndMT的相关治疗靶点以及发现潜在治疗药物是治疗肝纤维化的有益探索。表 皮 生 长 因 子 受 体（epithelial growth factor receptor，EGFR）被证明是一些癌症的相关治疗靶点，部分EGFR抑制剂已广泛应用于临床。Liang等10和Kaufman等11也研究了抑制EGFR的磷酸化，可以通过抑制肝星状细胞的激活来缓解肝纤维化的症状。虽然，EGFR已经被证明可以作为治疗肝纤维化的靶点，但对于以此为靶点治疗肝纤维化相关药物的报道较少，并且EGFR作为靶点治疗肝纤维化的潜在机制还有待进一步探索。本研究通过腹腔注射EGFR的靶向性抑制剂AZ-5104，观察其对小鼠肝纤维化的治疗效果，并探讨靶向性抑制EGFR对肝纤维化的相关治疗机制。1材料与方法1.1实验材料1.1.1 实 验 动 物从成都药康生物科技有限公司【SCXK（川）2020-034】购 买 8周 龄 12只 清 洁 级 雄性C57小鼠，体重（205）g。将购买的小鼠分 3笼饲养（每笼 4只），饲养于西南医科大学动物实验中心【SYXK（川）2018-065】，适应性喂养 1周后，对小鼠喂养高脂饮食饲料（21.1脂肪、41蔗糖和 1.25胆固醇），饮用 5的蔗糖溶液。所有动物实验均已获西南医科大学实验管理委员会批准（No：2020243）。1.1.2 实 验 药 物 和 试 剂EGFR抑 制 剂AZ-5104（CAS No：1421373-98-9）购买于上海MCE公司，CCl4购自上海吉至生化科技有限公司；-SMA抗体、FSP1抗体、CD31抗体均购买于武汉三鹰公司；HE染色试剂盒（CAS No：C0105M），购买于上海碧云天生物科技有限公司；天狼星红染色液（CAS No：PH1098）购买于上海PHYGENE生物科技有限公司。1.2实验方法1.2.1造模及给药方案雄性C57小鼠 12只，随机分为 3组，每组 4只，分别为正常组、模型组和给药组。模型组及给药组腹腔注射浓度为 20（0.8 g/kg）的CCl4，每 3 d注射 1次，共注射 4次，同时对模型组和给药组小鼠喂养高脂饲料和含有 5蔗糖的饮用水12。给药组小鼠腹腔注射EGFR抑制剂AZ-5104（10 mg/kg）（已被证明在体内外均具有高效性抑制作用）13，CCl4注射完成后次日注射药物，第 4次药物注射完成后，处死小鼠取材，将其肝脏分成 3份，1份用OCT凝胶包埋后，放入80 进行冰冻切片，1份在多聚甲醛中浸泡处理后进行石蜡切片，另 1份放入离心管速冻后备用。1.2.2HE染 色 将切好的石蜡切片放入 65 烘箱 2 h，烘好的片子放入二甲苯中脱蜡 510 min，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡 510 min。依次将片子放入 100无水乙醇 5 min，90乙醇 2 min，80乙醇2 min，70乙醇 2 min，蒸馏水 2 min。苏木素染色液染色 5