白姜花生理生化和细胞结构变化与花衰老的相关分析_肖望.pdf

北方园艺 （）：贮藏加工检测第一作者简介：肖望（），女，博士，教授，现主要从事植物生理学教学与科研等工作。：基金项目：广东省创新强校工程基础研究重点项目及应用研究重点资助项目（）；广州市科技计划资助项目（，）；广东第二师范学院大学生创新创业训练计划资助项目（，）；年 广 东 省科技 创 新 战 略 专 项 资 金（“攀登”计划专项资金）资助项目（）。收稿日期：白姜花生理生化和细胞结构变化与花衰老的相关分析肖望，涂 红 艳，陆 秋 婵，张 爱 玲，梁 水 珍，黄 金 维（广东第二师范学院 生物与食品工程学院，广东高校应用生态工程技术开发中心，广东 广州 ）摘要：以白姜花二倍体和四倍体切花为试材，通过蒽酮比色法、酸性茚三酮法和透射电镜法比较切花发育过程中生理生化指标和显微特征，解析影响白姜花切花衰老的生理机制，以期进一步了解白姜花切花衰老机理。结果表明：随着瓶插时间延长，二倍体花瓣和旗叶的可溶性糖含量显著下降，四倍体保持相对稳定并高于二倍体；花瓣可溶性蛋白质含量变化不明显，四倍体含量高于二倍体；花瓣脯氨酸含量呈现升高趋势，二倍体花瓣脯氨酸含量高于四倍体。花瓣和花冠管丙二醛含量变化不明显，花瓣丙二醛含量高于花冠管；二倍体花瓣和花冠管丙二醛含量均高于四倍体。花冠管相对电导率显著升高发生早于花瓣，四倍体花瓣和花冠管相对电导率显著升高发生晚于二倍体。在萎蔫期花瓣细胞出现空腔化，各种细胞器结构消失，出现小泡或囊泡。综上，细胞自噬是花瓣和花冠管细胞膜透性增加的原因。较高的可溶性糖和可溶性蛋白质含量以及花瓣和花冠管细胞质膜破坏推迟等是小花弯颈和花瓣萎蔫延迟的因素之一，有利于切花寿命的延长。关键词：白姜花；四倍体；切花；衰老；生理中图分类号：文献标识码：文章编号：（）白 姜 花（）属 姜 科（）姜花属（）植物，色泽纯白，外形美观，清香怡人，在我国南方和东南亚地区广泛种植，是颇受消费者喜爱的夏季重要香型切花品种。白姜花为顶生穗状花序，每个苞片内有朵小花通过花冠管与花序轴相连，花序寿命 ，每朵小花寿命 ，是一种典型的短命型观赏花卉。目前对白姜花的研究主要集中在花香成分分析、激素对花香物质合成影响、转录因子影响花香物质合成基因表达、花香物 质 合 成 的 转 录 组 分 析、离 体 组 织 培养 以及杂交育种 等方面。而延长切花寿命是目前白姜花产业亟待解决的问题之一。多倍体育种是改善花卉性状的有效途径，研究表明，四倍体具有延长花寿命的作用，如非洲菊（）四倍体的花寿命相比二倍体延长了。在烟草花（）中，多倍体植株的花冠管比二倍体的更短、更粗，可以有效地支撑花器官的伸展，帮助雌蕊得到普遍的授粉。花的衰老进程中会发生一系列的生理生化反应，主要体现在蛋白质的代谢、糖的代谢 以及生物膜透性的变化等方面。生物膜透性的变化一方面来源于活性氧对膜脂的过氧化，导致细胞膜系统损伤，细胞膜透性发生改变引起电解质外渗；另一方面来自膜蛋白变性引起离子泵失灵，导致质膜对离子的通透性的增加。课题组前期通过薄片培养技术结合秋水仙碱诱变获得了白姜花四倍体，切花具有瓶插寿命延长和香味增强等优良特征。基于此，该研究拟比较白姜花二倍体和四倍体瓶插过程中的生理生化指标差异，探讨影响白姜花切花寿命可能的生理生化因素，对白姜花的切花衰老机理进行进一步解析。材料与方法 试验材料二倍体和四倍体白姜花来自广州市从化区的种植基地。在月盛花季节，选取没有病虫感染、株型健壮、花朵开放程度较为一致的花枝，保留花枝长度为 ，将材料插入水中尽快返回实验室。将花枝浸入蒸馏水中斜切修剪，保留大约 的长度，插入装有 蒸馏水的锥形瓶中，每瓶支，于室温 左右环境进行瓶插，避免阳光直射。试验方法取开放程度一致的二倍体和四倍体白姜花枝，保留花枝旗叶（图），在瓶插期观察白姜花瓶插期间小花形态变化，以白姜花小花花萼裂开时的“苞裂期”标记为（图），每隔进行拍照，记 录 小 花 的 发 育 形 态，直 至 小 花 开 放（图）到萎蔫（图）。取材程序：以苞裂期记为，每隔，剪取不同发育时间节点的二倍体和四倍体花瓣和花冠管，每个时间节点至少选取 朵以上的小花花瓣及花冠管，剪碎、混匀，按照不同的目的称取不同质量的花瓣或花冠管，装入 冻存管放入液氮 后，然后取出放入 冰箱保存，用于各种生理生化指标的测定；每个时间节点取样至少重复次。项目测定 生理指标的测定可溶性糖含量采用蒽酮比色法 进行测定；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝 比色法 进行测定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法 进行测定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法 进行测定；相对电导率参考文献 的方法进行测定。花瓣的显微制片与透射电镜观察取二倍体的（盛花期）和（萎蔫期）、四倍体的（盛花期）和（萎蔫期）时期的花瓣，按照戊二醛固定、磷酸缓冲液冲洗、锇酸固定、磷酸缓冲液冲洗、梯度乙醇脱水、环氧丙烷置换乙醇、树脂浸样、烘箱聚合、超薄切片、铅铀双染等一系列步骤进行制片，在 透射电子显微镜下对切片进行观察，具体参考文献 。数据分析使用 和 软件对数据进行统计分析，通过多重比较、方差分析和检验分析数据之间是否存在显著性差异（）。注：旗叶（箭头所指）；苞裂期（箭头所指苞裂状态）；盛花期；萎蔫期（箭头所指：花瓣边缘水渍化）。：（）；（）；（：）图白姜花旗叶和小花不同时期的形态特征 北方园艺月月（上上）结果与分析 白姜花二倍体和四倍体旗叶可溶性糖含量的变化由图可知，白姜花二倍体旗叶的可溶性糖含量在瓶插为 ，瓶插 后可溶性 糖 含 量 显 著 下 降 至 （）；白姜花四倍体旗叶的可溶性糖含量在瓶插为 ，瓶插 后可溶性糖含量为 ，同瓶插初期相比几乎没有变化。注：表示差异显著，。下同。：图二倍体和四倍体白姜花旗叶可溶性糖含量的变化 白姜花二倍体和四倍体花瓣可溶性糖和蛋白质的变化由图可知，白姜花二倍体小花发育过程中，在苞 裂 期（）花 瓣 可 溶 性 糖 含 量 最 高，为 ；瓶插 后，花瓣可溶性糖含量开始显著下降，在 后小花衰败时可溶性糖含量显著降至最低为 （）。四倍体小花发育过程中，在苞裂期（）花瓣可溶性糖 含 量 为 ，瓶 插 后 为 ，可溶性糖含量在瓶插期间保持稳定，变化不显著，且含量明显高于二倍体。白姜花二倍体和四倍体花瓣可溶性蛋白质含量在瓶插期间保持比较平稳的状态，四倍体可溶性蛋 白 质 含 量 比 二 倍 体 稍 高（图）。在 瓶 插期间，二倍体花瓣可溶性蛋白质含量在 范围内波动，四倍体可溶性蛋白质含量在 范围内波动。方差分析及多重比较结果表明，在不同发育时间节点，二 倍体和 四 倍 体 花瓣 蛋白质含量变化差异不显著。图二倍体和四倍体白姜花瓶插期间花瓣可溶性糖含量的变化 图二倍体和四倍体白姜花瓶插期间花瓣可溶性蛋白质含量的变化 白姜花二倍体和四倍体花瓣脯氨酸含量的变化由图可知，白姜花二倍体花瓣在瓶插期间脯氨酸含量呈现明显上升的趋势，而四倍体变化不明显。二倍体在瓶插时脯氨酸含量最低，为 ，随着小花发育逐渐升高，在 时含量最高，达到 ；四倍体花瓣在整个发育期间，脯氨酸含量明显低于二倍第第期期 北方园艺体，在时含量为 ，瓶插，上升至 。方差和多重比较分析表明，白姜花二倍体、四倍体小花花瓣脯氨酸含量在各时间点差异不显著。图二倍体和四倍体白姜花瓶插期间花瓣脯氨酸含量的变化 白姜花二倍体和四倍体小花花瓣和花冠管丙二醛含量的变化由图可知，在二倍体小花发育过程中，各个瓶插时间节点，花瓣和花冠管的丙二醛含量差异不显著，同样四倍体小花花瓣和花冠管丙二醛含量差异不显著。在 的瓶插期间，二倍体花瓣和花 冠 管 的 丙 二 醛 含 量 分 别 在 、范围内波动；四倍体花瓣和花 冠 管 的 丙 二 醛 含 量 分 别 在 、范围内波动。同时，对相同时间节点的二倍体和四倍体花瓣和花冠管的丙图白姜花二倍体和四倍体小花发育过程中的丙二醛含量的变化 二醛含量进行显著性检验，结果表明，在瓶插、二倍体花冠管丙二醛含量显著高于四倍体（），其它时间节点差异不显著。总体而言，个倍性中花瓣丙二醛含量均高于花冠管，二倍体花瓣和花冠管的丙二醛含量均高于四倍体，在不同的时间节点差异程度不一致。白姜花二倍体和四倍体小花花瓣和花冠管相对电导率的变化由表可知，随着发育时间的延长，白姜花二倍体和四倍体小花花瓣和花冠管的相对电导率总体呈现上升趋势。至瓶插（二倍体和四倍体小花完全弯颈并萎蔫），花冠管和花瓣的相对电导率最高。二倍体花瓣的相对电导率在 呈小幅表二倍体和四倍体花瓣和花冠管相对电导率显著性分析 瓶插时间 花瓣 花冠管 二倍体四倍体二倍体四倍体 注：显著性检验限于同一个倍性样品电导率在不同瓶插时间点之间的差异；大写字母表示差异极显著。：；北方园艺月月（上上）注：二倍体瓶插完整细胞；二倍体瓶插细胞的局部放大；二倍体瓶插 完整细胞；二倍体瓶插 细胞的局部放大。四倍体瓶插完整细胞；四倍体瓶插细胞的局部放大；四倍体瓶插 完整细胞；二倍体瓶插 细胞的局部放大。黑色箭头为囊泡或小泡。标尺为。：；图白姜花二倍体和四倍体小花发育过程中花瓣亚细胞结构的透视电镜观察结果 度上升，在为 ，时为 ，总体变化趋势较为平缓；小花发育到 时花瓣的相对电导率显著升高至 （）。四倍体花瓣表现出与二倍体相似的上升规律，在 呈小幅度上升，至 时花瓣的相对电导率显著升高到 （）。结果表明，四倍体花瓣相对电导率突然升高的时间节点比二倍体推迟出现。与花瓣相比，个倍性花冠管的相对电导率起初均处于相对较高的水平。在时 二 倍 体 花 冠 管 为 ，四 倍 体 为 ；二倍体花冠管在 时相对电导率显著增高，达到 （），四倍体小花花冠管相对电导率在 显著增高（），达到 。总体上，二倍体和四倍体的花冠管相对电导率显著升高发生时间均早于花瓣，四倍体花瓣和花冠管相对电导率显著升高发生时间迟于二倍体。白姜花二倍体和四倍体小花花瓣亚细胞结构变化由图可知，在盛开期个倍性花瓣细胞细胞壁清晰，细胞结构完整，原生质被液泡膜挤压在边缘，紧贴细胞壁分布排列（，），各种细胞器结构完整，清晰可见（，）。在，花瓣细胞出现空腔化，各种细胞器结构消失（，），沿着细胞壁出现大量的小泡、囊泡状结构（和 中箭头所指）。推测在种倍性小花发育过程中，花瓣细胞通过细胞自噬的方式进行细胞程序性死亡（，），四 倍 体 花 瓣 细 胞 自 噬 解 体（）晚于二倍体（）。讨论与结论植物开花一段时间后，其花器官结构以同步方式启动衰老和死亡，这一过程发生和进展速度在不同的花卉中差异很大，如有些花能持续数月、数天，而有一些花如白姜花只能存活 左右，是一种典型的短命花。糖碳水化合物、蛋白质、脂质和核酸的大量分解是导致各种花器官衰老的重要因素 。细胞中糖含量的稳定不仅有助于改善细胞含水状态，还为维持细胞内的稳态提供能量，从而延长花的寿命 ，糖分含量变化被认为是启动衰老的重要信号，。一般花序第第期期 北方园艺的糖类主要由旗叶提供，白姜花二倍体的旗叶糖含量较低（图），且在瓶插后期显著下降，可能不再对花序进行持续的糖供应，而四倍体旗叶糖含量在整个瓶插期保持稳定（图），可能与四倍体植株具有较强的光合能力进而贮藏较高的糖含量有一定的关系，不过对于延缓花寿命需要进一步探讨。研究表明，石竹花花瓣糖含量下降时伴随花朵的衰老加速，而施以外源糖类可以延缓多种切花衰老和延长采后寿命，。该研究中，二倍体花瓣的糖含量在瓶插 开始显著下降（图），随着花衰老呈现显著的持续下降趋势，而四倍体含量在瓶插过程中保持平稳，四倍体具有较长的花寿命可能与其花瓣细胞糖含量较高且保持平稳有一定的关系。不过，未切花即使获得母体植株持续的糖分供应，其衰老也不可避免发生，外源糖对切花寿命的延长也只能推迟接近未切花寿命，即持续地对切花进行糖供应也不能阻止其衰老发生。在该研究中，四倍体旗叶、花瓣中糖含量一直保持稳定，并高于二倍体，推测较高的糖含量对白姜花四倍体的衰老推迟有一定的作用。个倍性花瓣蛋白质含量变化不明显（图），与白姜花小花衰老的关系还需要进一步探讨。离开母体对于切花是一种逆境，在瓶插期间脯氨酸和丙二醛的积累（一种膜脂过氧化产物，其相对含量直接反映膜脂过氧化的程度）、外渗液电导率的增大是体现植物抗逆性的重要生理指标。该