安胃汤对CAG大鼠NLRP...1β信号轴细胞焦亡调控研究_周志鹏.pdf

（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：曾梦楠，李 苗，张贝贝，等 葶苈子、薏苡仁、车前子的利水功效比较 中成药，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：周志鹏（），男（汉族），江西九江人，广西中医药大学研究生院在读硕士研究生，主要从事消化系统临床与实验研究工作通讯作者简介：韦 维（），男（汉族），广西宾阳人，广西中医药大学教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事消化系统疾病临床与实验研究工作安胃汤对 大鼠 信号轴细胞焦亡调控研究周志鹏，韦 维，陈 丽，晏振华，李嘉乐（广西中医药大学，广西 南宁）摘要：目的 从 信号传导通路细胞焦亡角度探讨安胃汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠疗效的作用机制。方法 采用甲基硝基亚硝基胍（）慢性萎缩性胃炎大鼠模型，应用安胃汤进行干预；运用 染色观察安胃黏膜组织形态改变；检测胃黏膜细胞焦亡；法检测血清 、水平的变化；检测 大鼠胃黏膜、的表达水平；检测 大鼠胃黏膜组织、蛋白的表达。结果 安胃汤能够明显改善 大鼠胃组织的病理变化，染色实验结果显示：观察组能够增加细胞凋亡；实验结果显示，与 组比较，组 表达均明显升高，有统计学意义（），组优于 组（）；与 组比较，组 表达均明显升高，有统计学意义（），组优于 组（）。实验结果显示：与 组比较，、组 表达均明显上升（），组优于 组（），组和 组无统计学差异（）；与 组比较，、组 表达均明显上升（），、组优于 组（）；与 组比较，、组 表达均明显上升（），、组优于 组（），组和 组无统计学差异（）。实验结果显示：与 组比较，、组、表达均明显升高（）；与 组比较，、组、表达水平有统计学意义（），、组 表达水平有统计学意义（），组无明显差异（）。结论 安胃汤能够明显改善 大鼠胃组织的病理变化，具有明显的抗 作用，其作用机制可能通过调控 信号传导通路诱导胃黏膜细胞焦亡有关。关键词：安胃汤；慢性萎缩性胃炎；实验研究 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）慢性萎缩性胃炎（，）是一种以胃黏膜固有腺体萎缩为特征的临床常见疾病，目前认为胃黏膜发生癌变遵循正常胃黏膜慢性非萎缩性胃炎慢性萎缩性胃炎肠上皮化生异型增生胃癌过程。年中华医学会消化内镜学分会报告，在各型慢性胃炎中慢性萎缩性胃炎比例为；在我国 年有近 万人因胃癌死亡，的癌变率为 ，在胃黏膜癌前病变中占有重要地位，慢性萎缩性胃炎的一般与胃癌的发病率呈正相关，中医、中药可以用于慢性胃炎的治疗，因此，通过药物治疗阻断慢性萎缩性胃炎进一步发展对防止胃黏膜癌变极为关键。细胞焦亡（）是一种伴随炎症反应程序性细胞死亡方式，是机体一种重要的天然免疫反应，在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。通路在细胞焦亡过程中发挥重要作用。如何通过药物对胃黏膜细胞因子细胞焦亡的进行调控成为指导抗 的重要策略之一。前期研究发现安胃汤治疗，其部分作用机制与促进局部胃黏膜的修复和腺体的再生有关，。本研究从 信号通路细胞焦亡角度探讨安胃汤抗 的作用机制，并观察了该方对 大鼠该通路关键因子、因子的影响，以期在炎症相关的细胞焦亡途径探究其作用机制，现将研究结果作如下报道：材料与仪器 药药物物 安胃汤为免煎中药颗粒（主要成分：半夏、黄连、干姜、百合、白芍、薏苡仁、乌药、丹参、炙甘草，其构成比为 ）；维酶素片（北海阳光药业有限公司生产，批号），以上药物均由广西中医药大学瑞康医院提供。动动物物 健康清洁级 大鼠 只，全部雄性，体质量，动物合格生产许可证编号（苏）。广西中医药大学动物福利伦理委员会，审查证明号：饲养环境：室温为（），相对湿度为（），采用标准鼠料及水饲养。时珍国医国药 年第 卷第 期 试试剂剂与与仪仪器器 甲基 硝基 亚硝基（）（公司）；试剂（公司）；反转录试剂盒（公司）；（公司）；试剂盒、显色剂（公司）；抗体：、内参抗体（公司）；蛋白裂解：（碧云天）；蛋白浓度测定试剂盒（公司）。型实时荧光定量 系统（公司）；型紫外分光光度计（公司）；型低温高速离心机（公司）；型恒压恒流电泳仪（北京六一仪器厂）。方法 实实验验大大鼠鼠的的分分组组、模模型型制制作作、给给药药 只大鼠随机取 只空白对照组大鼠常规饲养，自由进食饮水，只造模大鼠参照文献造模，模型大鼠仅自由饮用 的 液 周，给予普通饲料饲养；连续造模 周，分别于 周，周随机处死 只动物取材（每次正常组 模型组各 只），观察病理变化；病理染色确认模型造模成功后，选择 只空白对照组大鼠及 只 模型大鼠，入组进行分组给药实验。动物分组具体设置如下：动物分为 组，空白对照组（组）、病理模型组（组）、安胃汤大剂量组（组，成人 倍量）、安胃汤中剂量组（组，成人 倍量）、安胃汤小剂量组（组，成人 倍量）、维酶素对照组（组），每组 只，共计 只。从第 周开始，组、组大鼠每天每只按 标准灌胃生理盐水，安胃汤组每天分别灌胃给予安胃汤（组；组；组）；组维酶素混悬液（）灌胃；连续灌胃给药 周。取取材材及及检检测测 药物干预结束后，周末，禁食，处死动物，腹主动脉取血分离血清，冻存；部分胃组织 多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋；部分胃组织 一步法提取总；部分胃组织机械研磨，组织裂解液提取总蛋白。染染色色 切取 石蜡组织切片，按试剂盒说明操作，光学显微镜下观察胃组织病理改变并拍照分析。检检测测胃胃黏黏膜膜细细胞胞焦焦亡亡 按试剂盒说明操作，显微镜镜检，图像采集分析，并计数阳性细胞比例；法法检检测测血血清清 、水水平平的的变变化化 实验步骤严格参照对应指标的试剂盒说明书进行。检检测测胃胃组组织织 、表表达达 总 经反转录成，设计特异性引物，以 为内对照设定相对标准曲线，根据 值差异，检 测 和、基因的相对拷贝数，根据、拷 贝 数 与 拷 贝 数 的 比 值，检 测目的基 因 表 达 量 的 差 异。引 物 序 列：，：，：，：，引物序列由北京诺赛基因组研究中有限公司合成。检检测测胃胃组组织织 、蛋蛋白白表表达达 按试剂盒说明操作。以 为参照，根据条带灰度比分析、蛋白含量的差异。每组选取 个不同的样本重复上述实验。统统计计学学方方法法 采用 软件进行统计分析，结果以?表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用 法，为差异有统计学意义。结果 光光学学显显微微镜镜观观察察 空白对照组：胃固有层胃腺丰富，主细胞、壁细胞形态结构正常，未见明显炎症及其他异常（图 ）；病理模型组：胃组织黏膜层变薄，黏膜层底部胃腺数量减少，并伴有炎性细胞浸润。黏膜下层重度水肿，结缔组织排列疏松，亦可见炎性细胞浸润（图 ）；胃组织各层结构较为清晰，胃腺排列紧密，黏膜上皮可见局部脱落，黏膜层可见少量炎性细胞浸润（图 ）。黏膜下层局部重度水肿，结缔组织排列疏松，并伴有少量的炎性细胞浸润（图 ）。黏膜层胃腺数量减少，少量结缔组织增生，并伴少量的炎性细胞浸润，黏膜下层水肿明显，结缔组织排列疏松，亦存在炎性细胞浸润（图 ）。黏膜层底部胃腺数量减少，少量结缔组织增生，伴有较炎性细胞浸润，黏膜下层重度水肿，结缔组织排列疏松，并可见明显炎性细胞浸润。见图。检检测测胃胃黏黏膜膜细细胞胞焦焦亡亡 染色实验结果显示：正常组大鼠存在一定程度 阳性细胞，病理模型组大鼠 阳性细胞最少，安胃汤大剂量组 阳性与模型组比较有统计学意义（），中、低剂量组及维酶素对照组存在轻度 阳性细胞。见表，图。：空白对照组；：病理模型组；：安胃汤大剂量组；：安胃汤中剂量组；：安胃汤小剂量组；：维酶素组图 各组胃黏膜病理组织学变化（染色，）表 各组大鼠胃黏膜 阳性细胞表达（?）组别 染色结果细胞阳性率 空白组（）模型组（）安胃汤大剂量组（）安胃汤中剂量组（）安胃汤小剂量组（）维酶素组（）与模型组比较，；与维酶素比较，；组：正常对照组；组：病理模型组；组：安胃汤大剂量组；组：安胃汤中剂量组 组：安胃汤小剂量组 组：维酶素对照组图 各组大鼠胃黏膜细胞 阳性表达的影响（，）用用 法法，检检测测血血清清 、水水平平的的变变化化 实验结果显示，与 组比较，组 表达明显升高，有统计学意义（），组优于 组（）；与 组比较，时珍国医国药 年第 卷第 期 组 表达明显升高，有统计学意义（），组优于 组（）。见表。表 各组大鼠血清 、水平表达（?）组别剂量 空白组（）模型组（）安胃汤大剂量组（）安胃汤中剂量组（）安胃汤小剂量组（）维酶素组（）与模型组比较，；与维酶素比较，；各各组组大大鼠鼠胃胃组组织织中中 、基基因因表表达达的的差差异异 实验结果显示：与 组比较，、组 表达均明显上升（），组优于 组（），组和 组无统计学差异（）；与 组比较，、组 表达均明显上升（），、组优于 组（）；与 组比较，、组 表达均明显上升（），、组优于 组（），组和 组无统计学差异（）。见表。表 各组大鼠胃黏膜、表达（?）组别剂量 空白组（）模型组（）安胃汤大剂量组（）安胃汤中剂量组（）安胃汤小剂量组（）维酶素组（）与模型组比较，；与维酶素比较，；安安胃胃汤汤对对大大鼠鼠胃胃组组织织 、蛋蛋白白表表达达影影响响 实验结果显示：与 组比较，、组、表达均明显升高（）；与 组比较，、组、表达水平有统计学意义（），、组 表达水平有统计学意义（），组无明显差异（）。见表，图。表 各组大鼠胃组织、值比较（?）组别剂量 空白组（）模型组（）安胃汤大剂量组（）安胃汤中剂量组（）安胃汤小剂量组（）维酶素组（）与模型组比较，；与维酶素比较，；讨论在 的发病和病情发展中，胃固有腺体萎缩、减少是其重要的病理环节，有报道中医药可使部分的 伴肠上皮化生及异型增生减轻甚至消失。安胃汤为全国名老中医林沛湘教授治疗慢性胃病有效验方，临床疗效显著。细胞焦亡（）是一种伴随炎症反应程序性细胞死亡方式，是机体一种重要的天然免疫反应，在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞 内 容 物 的 释 放 进 而 激 活 强 烈 的 炎 症 反 应。（，）炎性小体和半胱天冬氨酸蛋白酶 在细胞焦亡过程中发挥重要作用。炎性小体是细胞内的一类多蛋白复合物，主要由巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞等分泌，通过感受微生物、应激、损伤信号等外界刺激，炎性小体激活半胱天冬酶（），进而裂解白介素（，）和白介素（，）释放，引发炎性级联反应，在炎症反应中起核心调控作用。细胞焦亡导致细胞质溶胀和通过破裂渗透裂解质膜，活化是通过炎性体诱导驱动的，促进蛋白水解成熟以及炎性细胞因 子 及 的活化和分泌，并裂解（）以诱导孔开放。和 均属于 超家族成员，是细胞内强力致炎因子，在急慢性炎症反应、发热反应等病理过程中发挥重要作用。细胞因子 和 在适应性免疫激活中发挥不同的功能，促进免疫，抵抗过度的免疫病理学改变。基因多态性与癌前胃病变相关萎缩性胃炎、肠化生和发育不良相关。基因多态性包括 （）和 （），已被证明与胃癌发生密切相关。参与了包括炎症反应和分泌胃酸多种细胞活动，近来研究表明，在固有免疫中起核心作用的炎性小体，亦可通过调节适应性免疫在多种疾病包括自身免疫病中的发病机制起关键作用，家族作为前炎症因子，和急慢性炎症相关，在固有免疫中发挥重要作用。目前认为 信号轴是由 依赖性介导的经典细胞焦亡通路发生的重要机制，在感染性疾病、自发性炎性疾病、自身免疫性疾病和相关癌症等疾病中扮演着重要的角色。上样顺序从左到右，组：正常对照组；组：病理模型组；组：安胃汤大剂量组；组：安胃汤中剂量组；组：安胃汤小剂量组 组：维酶素对照组图 各组大鼠胃组织、蛋白表达原始 条带结果 炎性小体由 样受体样受体家族成员、衔接蛋白（，）和炎性蛋白酶 组成。是其中的核心蛋白，包含 个结构域：端的 域（，），通过介导蛋白间的相互作用而转导信号；端的 域，通过介导蛋白间及蛋白与糖脂间的互作用探测和识别病原体及其他配体；及位于分子中央的 域，通过调节分子的自我寡聚体化从而在分子的活化中起重要作用。的基因多态性和胃肠道肿瘤的风险有关，幽门螺杆菌可通过其毒力因子 引起钙离子外流，活性氧（）产生，线粒体膜电位降低，