136生物技术对鱼类养殖的潜在影响.pdf

收稿日期：2005-01-24基金项目：浙江省自然科学基金项目（302438）和宁波市青年基金项目（2003A62023）作者简介：钱鸿卿，1979年生，男，在读研究生，研究方向为水产经济动物增养殖。生物技术对鱼类养殖的潜在影响钱鸿卿，薛良义，李卢（浙江宁波大学生命科学与生物工程学院315211）摘要：随着科学技术的发展，除了传统的生物技术之外，分子技术的应用已经为提高世界水产养殖品种产量开辟了另一条途径。基因组信息库的增长，极大地提高了科技工作者对确认一些表现型基因的能力。转基因技术和目前尖端的技术：诸如DNA芯片技术、高分辨力的二维凝胶技术和高灵敏度的质谱仪等技术的发展联系起来，向水产养殖工作者展现出了一片美好的前景：包括生长率和经济效益的增加、抗病能力和抗冻能力的提高、养殖品种种质的改善以及通过改变它们的基因组成而创造出新的不同的品种。讨论了与功能基因组领域相关的技术以及它们在水产养殖领域中的应用。关键词：生物技术；鱼类养殖；潜在影响中图分类号：$917文献标识码：A文章编号：1003-1278（2005）05-0007-03伴随着功能基因组与转基因技术的发展，生物技术领域中出现了新的研究方法。这些新的研究方法在水产生物技术方面具有巨大的潜在应用价值，能使我们满足对水产品不断增长的需求。在此，笔者就生物技术对鱼类养殖不同领域的影响作一个初步的评述。!促进生长把大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内，获得了“超级小鼠”，证明了可以通过引入外源生长激素基因来控制生长率。崔宗斌1等运用基因转移技术，将含有人生长激素基因的重组DNA导入鱼的受精卵内，获得了快速生长的转基因鱼，证明了外源基因在受体鱼内的整合、表达和促进生长作用。这些结果表明了鱼类基因工程育种的可行性。这一技术已经成功运用于包括鱼在内的其它多种动物当中。转基因鱼，特别是在鲑科鱼类，表现出了很强的生长力。注射外源生长激素基因的成年鲑鱼促生长效果平均为对照组的3!5倍，对某些个体，尤其在生长的最初几个月，其生长速度可以达到对照组的10!30倍。在其它的一些鱼中，虽然得到相似的结果，但促生长效果都没有在鲑科鱼类那样显著。转基因鱼一般能健康生长，有一些还能繁殖出第二代和第三代转基因后代；而且，增强的表现型与基因型一同被遗传。这种方法与选择育种法相比，经济上的优势是显而易见的，而最重要的是达到同一目的所需要的时间明显缩短。1997年，M cPherron2等人从小鼠身上克隆到了GDF-8基因，发现该基因敲除的小鼠，其肌肉含量增加了1倍，体重增加了30%，而脂肪含量没有相应增加。该基因突变的牛肌肉特别发达。由此引起了育种学家对该基因的兴趣，至今已克隆了斑马鱼、虹鳟、金鲷、罗非鱼、大西洋鲑等10多种鱼的GDF-8基因，笔者实验室也从我国名贵鱼类大黄鱼上克隆到了这一基因。目前，鱼类GDF-8基因的功能正在研究之中。如果鱼类GDF-8基因具有像哺乳动物那样的功能，该基因可用于改良养殖鱼类的品质。目前，已在鲤、鲑等多种鱼类获得了外源基因，能够整合、表达和遗传的转基因鱼。从安全性、外源基因的表达强度以及基因产物的生物学效应等方面考虑，为鱼类育种而进行的基因转移，采用人生长激素基因和重金属结合蛋白基因的启动子是不够理想的，而应当建立来自鱼类自身的“全鱼基因”。Du3等最先使用“全鱼基因”向大西洋鲑受精卵转移生长激素基因，获得的转基因鱼个体的重量比对照组平均大3.8倍，转基因鱼子一代个体的平均重量比对照组大5.2倍。美国科学家把虹蹲生长激素基因导入鱿鱼，缩短了养殖周期；培育的转基因鲤可增产20%!40%。这些成果使鱼类转基因技术从实验室研究向生产应用迈进。提高耐低温能力除了生长激素外，抗冻蛋白基因已经引起了人们的重视。水体温度过低对很多鱼体都会造成相当大的应激反应，很少有鱼能在低于1 C冷水中存活下来。在温和气候里生活的敏感鱼群在遇到罕见的低温时，甚至可能会全部死亡，因而低温对鱼类的影响，成为了在水产养殖中较为严重的问题。但是，一些硬骨海水鱼类含有很高水平（10!25mgmL）的血清抗冻蛋白（AFP）或血清抗冻糖蛋白（AFGP）4，5，它们通过阻止冰晶的生成能够有效地降低冻结温度。大多数抗冻蛋白主要在肝脏中表达，在一些鱼体中，发现该蛋白也可以在皮肤、鳃和其它外周组织中表达。H ew4等为了使缺乏抗冻基因的名贵鱼类获得寒冷环境中生存的能力，把抗冻蛋白基因注射到缺乏该基因的大西洋鲑受精卵中，结果3%个体整合了抗冻蛋白基因。整合的外源基因具有遗传稳定性，而且抗冻蛋白基因的表达具组织特异性，表达的量受季节影响。但是转基因鱼中抗冻蛋白的量还不足以产生抗冻的效果。今后72005年第25卷第5期水利渔业（总第141期）万方数据要提高启动子的增强效应或者增加基因剂量。在其它的脊椎动物当中，该蛋白家族也可以保护它们的细胞膜不受寒冷和冻结的损害，这可能是通过改变该动物的膜结构来实现的。研究表明，鱼体的这些抗冻蛋白能够帮助羊胚胎在低温（4 C）的情况下保存，低温贮藏AFP能够保护猪卵母细胞膜免受冰冻的损害6。不过，AFP在低温贮藏鱼卵和胚胎中的作用还有待于进一步研究。!增强抗病能力目前，在养殖过程中过多地使用抗生素来控制水产养殖动物疾病的发生，往往会降低养殖品种的商品价值，而且会对水体造成极大的污染。运用DNA疫苗技术和抗菌因子技术就能很好地解决这两个问题。前者是通过注射裸露的部分编码抗原的DNA（通常是编码病毒外膜或病毒外壳蛋白的DNA），使得蛋白在体内表达和诱导抗体的产生。这种方法已成功地应用于多种鱼类。如将编码传染性造血组织坏死病毒（I HN）糖蛋白的基因注射到大西洋鲑，8周后的攻毒试验表明，这些鱼获得了明显的抗病能力，在12周后仍具疾病抵抗能力。这表明在初步免疫后，鱼体内产生了中和抗体。另外，用糖蛋白编码序列作为预防出血性败血病病毒（HS）的疫苗接种到虹鳟体内，也得到了类似的结果7。然而，要想在水产养殖中推广这一技术，许多鱼类的免疫途经问题依然是一个相当大的障碍。抗菌因子技术是通过使用抗菌蛋白产生非特异性免疫反应。科技工作者已经在许多真核生物中发现了这种蛋白。但是，除了溶菌酶外，对其它抗菌蛋白的非特异性抗菌作用机制的了解并不多。目前，有些科学家将编码多种抗菌蛋白包括溶菌酶的基因转移到鲑鱼当中，如果溶菌酶的表达水平与鲑鱼抗病力有较好的相关性，那么，带有溶菌酶基因的转基因鱼将承受各种微生物的挑战8。除此之外，主要组织相容性复合体（MHC）是一组编码，是所有脊椎动物免疫系统功能必需的膜蛋白基因。其中，MHC单元型表达与抗病密切相关。有报道显示，在流行病后仍存活的一些鱼体能“抗病”9。随着科学家对鱼类MHC等位基因表达与抗病间联系的深入研究，也可以为水产养殖者提供优良的繁殖群体。控制繁殖行为诱导鱼类产卵的传统方法在很大程度上依赖于外部模拟繁殖条件的刺激作用或者直接注射促性腺激素或垂体匀浆。现在，在水产养殖中仍然普遍使用这些方法诱导产卵。在雌雄个体大小存在较大差异或性成熟时个体较小的鱼类，如罗非鱼，人们更喜欢单性养殖。能达到这一目的的方法有很多，如相近种之间的特异性杂交，雌核发育，用雄性激素诱导鱼苗发育成雄性等。三倍体鱼具有不育性，因而诱导三倍体的技术也可用于控制鱼类的繁殖。转基因技术的运用进一步强调需要生产不育的子代，以减少转基因品种与野生种混合的风险。转基因技术的发展既能生产出不育鱼、又能用可诱导的启动子特异性控制这些鱼的繁殖行为成为可能。这种方法的可行性已经在小鼠体内获得了证明，小鼠体内与C re-lOXP系统融合的特定基因，经四环素或者强力霉素处理能被激活10。这种系统在鱼类中的应用将能使基本上不育的鱼得以保存，当养殖需要时，这种鱼的生育能力可被激活。很明显，这一技术具有相当大的市场价值，既获得了最佳的生长速度，又控制了转基因品种的繁殖，从而确保任何逃离鱼将不能繁育。#确定特定表型的基因通过对鱼类基因组研究，我们可以确定与某种特定品质有关的基因。在功能基因的研究领域中，目前使用的方法包括通过CDNA微阵列以及通过比较受到不同处理的整个组织或细胞的蛋白质组来看基因的不同表达。用这种方法可以确定许多基因的功能，其中的一些将会运用于水产养殖当中。其中通过CDNA微芯片技术能反映多个基因表达水平的变化。有报道显示，一些研究小组已经利用CDNA微芯片评估实验动物的mRNA水平的变化，例如1997年报道在斑马鱼中，它的序列表达标签（EST）克隆的数目有85 586个。目前，在6种不同的美洲拟鲽组织中克隆出了900个EST，而在普通的鲤科鱼类，尼罗罗非鱼和虹鳟的种类组织中也克隆出了约300个EST11。蛋白质筛选是另一种更好的评估因生理学或药理学的改变而改变表达水平的方法。通过改进二维凝胶技术，提高质谱仪的性能，能提供更精确的多肽质量图谱和高质量的片段图谱12。与CDNA微芯片技术相比，蛋白质筛选技术的另一个优点是能确认翻译后的修饰。这在细胞信号途径中是特别关键的，因为在细胞信号途径中，磷酸化常常意味着蛋白质被活化。目前，一些使用蛋白质组学方法的研究包括：在虾的白斑病毒寻找抗原蛋白，开发出合适的疫苗；在细胞中检测生殖激素信号的不同调控蛋白进而控制生殖发育和产卵；以及在海马苗周围孵卵流体中寻找有生物学活性的蛋白。其研究成果对于海洋生物资源的可持续利用具有非常重要的意义。$DNA标记辅助繁育通过与数量性状基因座（GTL）连锁的DNA标记评估个体的生产潜力称为标记辅助选择（MAS）。Gelder man和SOller在20世纪70年代就提出了标记辅助选择及提高杂合度中应用遗传标记的理论。目前，最常用的遗传标记是限制性片段长度多态性（RFLPS）和随机引物扩增多态DNA（RAPD）。限制性片段长度多态性（RFLPS）是指用某种限制性内切酶切割基因组DNA时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序列的酶切片段长度差异。目前常利用RFLP技术对水产动物的线粒体DNA进行研究，由此找出其线粒体DNA标记。N ielSen13等利用该技术对野生大西洋鲑丹麦品种和其它一些欧洲品种的线粒体DNA8（总第141期）水利渔业2005年第25卷第5期万方数据进行分析，结果发现它们之间基因差异非常明显。然而，对核基因组来说，RFLP操作较为繁琐，多态性信息也较低，现在越来越多地使用其它的DNA标记。随机引物扩增多态DNA（RAPD）是在PCR技术的基础上，一系列不同随机排列的寡聚核苷酸单链为引物，结合到加热变性后模板上使之退火。在DNA聚合酶的作用下，合成一段新的互补DNA链。合成过程中，引物可能与单链DNA有多个特异性结合位点，只要引物间距在2UU!2 UUU bp范围内，就可以进行PCR扩增。这样经过n次循环，理论上就可形成2n条新链。如果亲代有不同带谱，在子代中就会发生分离。由于RAPD的引物是随机的，一套引物可用于多个物种的基因组DNA多态性分析；此外，它还具有所需摸板DNA的量少，标记遵从孟德尔遗传规律等优点。因此它已经成为遗传分子标记中最重要的标记，广泛应用于种间遗传标记、抗病性状遗传标记等方面。笔者实验室也利用RAPD技术对象山港养殖花鲈群体进行了研究。结果显示，目前象山港养殖花鲈种群内的遗传多样性比较丰富。选择培育与分子标记特定品质相结合更易于确定可遗传的特征，比如生长率、繁殖率、抗病力和观赏鱼的颜色和形状特征；相关基因可以通过分子标记选育鱼来描绘基因座位。!新的观赏鱼品种目前对观赏鱼类的需求不断增加，为利用转基因技术开发具有新的形状和颜色的新品种打开了市场。现今应用于开发观赏鱼表型多样性的主要方法为注射染料和选择育种，很明显，转基因方法在开发新品种方面比这两种方法具有更大的可行性，而且效果更好；此外，利用基因编码的荧光蛋白，如红（RFP）、蓝（BFP）、黄（YFP）、青色（CFP），以近乎无穷变化的不同组合可以产出绿、红、蓝、黄或青色鱼体。据报道，把荧光色素编码基因融入鱼体组织特异性启动子上，成功地培育出新颜色的观赏鱼类。到目前为止，GFP、RFP和YFP可以分别在皮肤或骨骼肌中得到表达，人们在日光下就可以看到绿色、