不同pH值消化液对ST细胞分散作用的影响_范珞菲.pdf

福建畜牧兽医第45卷第1期2023年不同 pH 值消化液对 ST 细胞分散作用的影响范珞菲兆丰华生物科技（福州）有限公司福州350014摘要本试验采用不同pH值胰蛋白酶消化液分别消化转瓶ST细胞，并观察记录ST细胞消化时间、分散效果、瓶壁残留情况、细胞计数、细胞粒径以及细胞再次贴壁生长状态，获得转瓶培养ST细胞的胰蛋白酶消化液最佳pH值，为ST细胞在转瓶传代培养过程中出现的细胞不脱壁、团块大的问题提供数据支持。关键词胰蛋白酶消化液pH值ST细胞细胞培养文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）01-0009-03Effect of different pH digestion ates on dispersion of ST cellsFan Luofei（Jofunhwa Biotechnology(Fuzhou)Co.Ltd,Fuzhou 350014）Abstract In this experiment,the trypsin digestion solution with different pH values was used to digest ST cells in the rotating bottles,and the digestion time,dispersion effect,residual condition of the bottle wall and the state of cell adherent growth were observed andrecorded,so as to obtain the optimal pH value of trypsin digestion solution for ST cells digestion.To provide data support for solvingthe problem that ST cells do not exfoliate from the wall and are prone to form large clumps in the process of transflask culture.Key words Trypsin digestion solution pH ST cells Cell culture猪睾丸细胞（Swinetes，ST）是由猪睾丸分离得到的一种成纤维样细胞，可连续体外传代培养，细胞呈贴壁生长1。该细胞属于病毒敏感型细胞系，能感染多种病毒，如猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV）2、猪 瘟 病 毒（Classicalswine fever virus，CSFV）3、猪细小病毒（Porcine par-vovirus，PPV）4、伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）等5。在疫苗制备中，用于繁殖病毒的细胞是关键原辅材料之一。细胞培养质量好坏，直接影响到病毒类疫苗质量。ST细胞作为贴壁型细胞，可在方瓶、转瓶上进行传代培养。在传代过程中胰蛋白酶作为消化液具有很好的分离细胞的作用。转瓶培养过程中，存在ST细胞对所使用的消化液不敏感、出现细胞不易脱壁现象，而同代次方瓶培养的细胞没有发现该现象。因此，为解决转瓶细胞不易脱壁问题，本文采用同一浓度、同一温度、不同pH值消化液对ST细胞进行消化，通过消化时间、分散效果、瓶壁残留情况、细胞计数、细胞粒径以及细胞再次贴壁生长状态，获得消化ST细胞的胰蛋白酶消化液最佳pH值，为后期研究ST细胞提供数据参考。1材料1.1细胞ST细胞：由大北农集团北京动物医学研究中心提供。1.2主要试剂胰酶（1:250）：购自美国碧迪医疗器械有限公司；新生牛血清：购自兰州荣晔生物科技有限责任公司；培养液：DMEM培养基；其余试剂购自国药公司，分析纯。1.3仪器与设备pHS-3C便携式pH计：上海仪电科学仪器有限公司；37XB倒置生物显微镜：上海光学仪器一厂；流式库尔特细胞计数仪：江苏卓微生物科技有限公司。2方法2.1消化液制备按照试验需要量称取胰酶（1:250），并溶解于PBS缓冲溶液中，用7.5%NaHCO3溶液调节消化液的pH值。将消化液的pH值调整为数值不同的4组，第1组为6.41、第2组为7.03、第3组为7.65、第4组为8.04，其中第2组消化液是日常用，作为对照组。2.2转瓶细胞制备取生长状态良好且铺满T175细胞培养瓶的ST细胞，弃去细胞培养液，加入PBS缓冲溶液清洗12遍，倒入适量的消化液进行消化，待细胞出现明显圆缩、间隙变大时，弃去消化液，用移液管吸取810 mL含有血清的培养液轻轻吹打T175细胞培养瓶，待细胞完全分散后按一定比例等量分装至10 L转瓶中，补足培养液，置37 恒温室中培养。2.3转瓶细胞消化提前将4组不同pH值的消化液进行预热，观察转瓶细胞，待细胞长至单层致密状态，每组分别选取3瓶10 L转瓶细胞进行消化传代，弃去细胞培养液，用PBS缓冲溶液清洗2遍，倒入消化液进行消化，待细胞出现圆缩、间隙变大时，加入含有血清的培养液，快速甩动转瓶，使细胞从瓶壁上分离下来，用移液管吸取每瓶细胞悬浮液1 mL9福建畜牧兽医第45卷第1期2023年到6孔细胞培养板中，用倒置显微镜观察细胞分散情况，其余的细胞悬浮液按一定比例等量分装于10 L转瓶中，补足培养液，置37 恒温室中培养。2.4记录观察记录4个试验组细胞消化时间，观察细胞分散效果、瓶壁残留情况、细胞计数、细胞粒径以及培养24 h、48 h时ST细胞生长状态。3结果与分析3.1消化时间及瓶壁残留情况对比由表1可知，从消化时间上看，第1组和第2组消化时间比第3组和第4组长；从瓶壁残留情况上看，使用第1组和第2组消化液，细胞大部分未脱壁或一半脱壁，使用第3组和第4组消化液，细胞全部脱壁。由此可看出，在ST细胞培养消化过程中，消化液pH值达到7.65和8.04时，作用力强于偏酸性或者中性的消化液，使细胞在较短时间内从瓶壁上完全分离。3.2分散效果及细胞贴壁情况对比由表1可知，第2组和第3组细胞分散效果均是几个细胞抱团，第1组分散效果是单个及几个细胞抱团，第4组分散效果是大团块。细胞分散效果直接影响到细胞贴壁。细胞团块越大，越容易导致细胞贴壁不均匀或者不易贴壁，因此使用第1组、第2组和第3组消化液消化的ST细胞，贴壁均匀。3.3细胞生长情况对比由表1可知，第1组、第2组、第3组分散效果呈单个及几个细胞抱团，贴壁均匀，但是细胞消化时间越长，细胞生长情况越差；第4组细胞消化时间最短，但是由于分散后的细胞团块大，贴壁不均匀，导致其细胞生长情况受到影响。3.4细胞密度及细胞粒径情况对比由表2可知，第2组和第3组细胞分散效果呈几个细胞抱团，两组在细胞密度以及细胞粒径上看相差不大；第1组分散的细胞多为单个，细胞密度最大、粒径最小；第4组分散的细胞团块大，细胞密度最小、粒径最大。4小结与讨论不同的细胞对胰蛋白酶消化液浓度、pH值、温度以及消化作用时间要求都是不一样的6。本文对细胞消化时间、密度、粒径、贴壁状态及生长状态等方面进行试验、观察及分析，胰蛋白酶消化液在pH值为7.65时更适用于转瓶ST细胞培养，其消化分离的细胞状态呈单个或者几个细胞抱团，贴壁均匀且生长旺盛，48 h时达到单层致密状态。在pH7.28.4、温度为37 时，胰蛋白酶消化液作用能力最强7。本试验结果表明，当消化液pH值达到7.65和8.04时，消化时间短，细胞全部脱壁。由此得出，胰蛋白酶消化液在偏碱性的环境下，作用力强于偏酸性或者中性环境。要保持细胞的活性，除了保证胰蛋白酶消化液在偏碱性的环境下，还要减少胰蛋白酶消化液对细胞的作用时间8。胰蛋白酶消化液对细胞作用时间过长，会对细胞造成不可逆的损伤；作用时间过短，细胞解离效果不理想，因此，在ST细胞消化过程中要时刻及时关注细胞状态，寻找最符合该细胞生长的培养条件。本文探讨了ST细胞在转瓶传代培养过程中出现的细胞不脱壁、易成大团块的问题。在转瓶培养ST细胞传代过程中，应时刻关注ST细胞对胰蛋白酶消化液最适的浓度、温度及pH值等条件的敏感度，以免消化过度对细胞造成损伤，影响细胞生长状态。参考文献：1彭丽英,章伟建,张华弟,等.ST细胞的鉴定及种子细胞库的建立J.山西农业大学学报(自然科学版),2014,34(4):336-338,379.2周燕,王建超,华平,等.猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究J.中国兽医科技,2005,35(6):423-427.3刘宁,时洪艳,陈建飞,等.猪瘟病毒衣壳蛋白的细胞核定位J.中国预防兽医学报,2014,36(1):72,80.4殷震,刘景华.动物病毒学M.2版.北京:科学出版社,1977:1151.5彭丽英,倪建平,张婉华,等.猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖的研究J.上海农业学报,2011,27(4):67-69.6程宝鸾.动物细胞培养技术M.广州:中山大学出版社,表1不同pH值消化液对ST细胞生长消化的影响组别pH值消化时间（min）分散效果瓶壁残留情况细胞生长情况24 h48 h12346.417.037.658.04302042单个及几个细胞抱团几个细胞抱团几个细胞抱团大团块细胞大部分未脱壁细胞消化一半细胞全部脱壁细胞全部脱壁细胞贴壁均匀，约铺满30%细胞贴壁均匀，约铺满50%细胞贴壁均匀，约铺满70%细胞贴壁不均匀，约铺满60%未长满细胞单层细胞单层致密细胞单层略密消化液编号pH值细胞密度（cells/mL）细胞粒径（m）12346.417.037.658.044.201062.441063.301061.4310615.5816.6016.1317.76表2不同pH值消化液对细胞密度及细胞粒径的影响10福建畜牧兽医第45卷第1期2023年2006:44.7赵新兰.动物细胞培养的有关事项J.新课程(上),2011(5):134-135.8 Freshney R I.动物细胞培养:基本技术和特殊应用指南M.7版.章静波,徐存拴译.北京:科学出版社,2019:267.宁德市蕉城区猪场圆环病毒病流行情况调查与防控对策王茂文宁德市蕉城区畜牧兽医站福建宁德352100摘要通过采集蕉城区不同类型猪场的猪血清及病料进行圆环病毒病抗体、抗原检测，了解蕉城区猪场圆环病毒病的免疫状况及野毒感染现状，及时掌握流行病学动态，从而有针对性地开展防控工作。关键词猪场圆环病毒病流行情况调查防控对策文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）01-0011-02Prevalence investigation and prevention and control measures of circovirus diseaseon pig farms in Jiaocheng district,Ningde cityWang Maowen(Jiaocheng District Animal Husbandry and Veterinary Station,Ningde City,Fujian 352100)Abstract By collecting pig serum and disease samples from different types of pig farms in Jiaocheng District,the antibodies and anti-gens of circovirus disease were detected to understand the immune status of circovirus disease and wild virus infection of pig farms inJiaocheng district,timely grasp the epidemiological trends,so as to carry out targeted prevention and control work.Key words