半夏3种花叶病毒的mRT-PCR鉴定及遗传进化分析_李锦超.pdf

第 46 卷第 1 期2023 年 1 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.1Jan.2 0 2 3半夏 3 种花叶病毒的 mRT-PCR 鉴定及遗传进化分析李锦超1，董俊美1，孟义江2，杨太新1，葛淑俊1（1.河北农业大学 农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室，河北 保定 071000；2.河北农业大学 生命科学学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室，河北 保定 071000）摘要：半夏（Pinellia ternata）因长期无性繁殖导致病毒病高发。本研究以河北安国疑似病毒感染的半夏为材料，通过优化扩增反应体系及反应程序，建立了可以同时检测黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）和芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）的多重 RT-PCR 体系，RNA 稀释 106倍时亦能同时检测 3 种病毒。对侵染病毒外壳蛋白进行基因克隆和遗传进化分析，结果表明CMV 的外壳蛋白编码区序列为 657 bp，与浙江侵染半夏的 CMV（DQ399550.1）序列相似性高达 96.16%，与感染其他寄主的病毒序列差异较大；SMV 和 DsMV 外壳蛋白序列分别为 843 和 828 bp，与同种株系遗传变异度分别达到 0.38 和 0.37 以上，独立为 1 个进化支。生物信息学统计分析发现，病毒外壳蛋白序列高度保守，具有较为丰富的变异位点，碱基转换率大于颠换率，CMV AT 偏倚度大于 GC，SMV、DsMV 与之相反。研究结果为半夏病毒检测和脱毒提供了技术和理论基础。关 键 词：半夏；花叶病毒；多重 RT-PCR；遗传进化中图分类号：S432.4+1 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标识码：A mRT-PCR identification and genetic evolution analysis of mosaic viruses in three Pinellia ternata LIJinchao1,DONGJunmei1,MENGYijiang2,YANGTaixin1,GEShujun1（1.College of Agronomy,Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Crop Germplasm Resources research and Utilization in North China,Ministry of Education,Baoding 071000,China;2.College of Life Science,Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Crop Germplasm Resources research and Utilization in North China,Ministry of Education,Baoding 071000,China）Abstract:The incidence of viral disease is high in Pinellia ternata due to long-term asexual reproduction.In this study,a multiplex RT-PCR system was established to detect Cucumber mosaic virus(CMV),Soybean mosaic virus(SMV)and Dasheen mosaic virus(DsMV)simultaneously in pinellia that was suspected of virus infection in Anguo,Hebei Province.After optimizing the amplification reaction system and reaction procedure,three viruses could be detected at the same time when the RNA was diluted 10 million times.The genes encoding the viral coat protein were cloned and their genetic evolution were analyzed.The results showed that the CMV coat protein(CP)was encoded 收稿日期：2022-10-23基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-21）；河北省现代农业产业技术体系中药材产业创新团队（HBCT201806201，HBCT201806202）.第一作者：李锦超（1997），男，河北廊坊人，硕士研究生，从事药用植物种质资源研究与利用.E-mail:stitch_通信作者：葛淑俊（1970），女，河北滦县人，博士，教授，从事药用植物种质资源鉴定和育种.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)01-0080-08DOI：10.13320/ki.jauh.2023.001281第 1 期by a sequence of 657 bp that was 96.16%similar to the CMV(DQ399550.1)sequence isolated from virus infected Pinaceae from Zhejiang Province and significantly different from virus infected other hosts.The sequences encoding the coat proteins of SMV and DsMV were 843 bp and 828 bp.Their genetic variation of other SMV and DsMV was above 0.38 and 0.37,and they were in an independent clade in the phylogenetic tree.Statistical analysis of the CP sequences showed that the virus coat protein sequences included highly conserved domains and regions with abundant mutation sites in which base conversion rate was higher than inversion rate,and the AT skew was greater than GC for CMV that was opposite in SMV and DsMV.The results will provide a technical and theoretical basis for virus detection and detoxification of Pinellia ternata.Keywords:Pinellia ternata;mosaic virus;multiple RT-PCR;genetic evolution半夏（Pinellia ternata）为天南星科半夏属植物，始载于神农本草经，列为下品，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效1，是中医临床上治疗湿痰咳嗽的要药2，现代毒性及药理研究证明半夏还具有抗肿瘤作用3。半夏采用无性繁殖方式，在生长期内极易受各类病毒的侵染，并通过局部进化、寄主转变、混合侵染和远距离传播等产生新型病毒，形成连续性、扩散性病毒病害，防治策略复杂、难度很大4。有研究表明侵染半夏的主要是花叶病毒，以黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒、魔芋花叶病毒（Konjac mosaic virus,KoMV）、烟 草 花 叶 病 毒（Tobacco mosaic virus,TMV）以及大豆花叶病毒为主5，可单一侵染或复合侵染，感染率呈明显的区域性分布，引起花叶、皱缩和矮化等症状，致使产量下降，品种退化6。黄瓜花叶病毒为雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，是世界上寄主范围最广、危害最严重的植物病毒之一，在 1 000 多种植物中均有 CMV 侵染状况的发现7；大豆花叶病毒是马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）的成员之一，寄主范围较窄，在世界所有大豆产区均有发生，给大豆产量和种子质量造成巨大损失8；芋花叶病毒为马铃薯 Y 病毒属成员，是世界上天南星科植物的重要病毒病原，寄主多达 16 属以上9。河北省半夏种植面积大，范围广，在多年无性繁殖中病毒感染率较高，其中复合侵染率约为 60%10。本课题组前期已鉴定出其侵染病毒主要是CMV、SMV、和 DsMV，为提高鉴定效率，本研究拟通过调节影响 PCR 反应的各因素，建立稳定高效的多重 RT-PCR（Multiplex RT-PCR，mRT-PCR）病毒检测体系，并克隆病毒外壳蛋白（Coat protein，CP）序列进行生物信息学分析，以明确其遗传特征及系统进化特点，为半夏病毒病的防治提供参考。1 材料与方法1.1 材料在河北省安国市中药都药博园半夏种植区，将具有花叶、皱缩、畸形、黄化、坏死等症状的疑似病毒病的单株，采集幼嫩叶片置于-80 冰箱保存备用。1.2 方法1.2.1半夏总 RNA 提取及第一链 cDNA 合成 称取 0.1 g 半夏叶片，加入液氮充分研磨至粉末状，迅速转至无 RNase 的 1.5 mL 无菌 eppendorf 管中。总 RNA 提 取 按 照 康 为 世 纪 OminiPlant RNA Kit（DNase I）说明书执行。cDNA 反转录参照康为世纪 HiFiScript cDNA Synthesis Kit（cDNA 第一链合成试剂盒）说明书执行。1.2.2 多重 RT-PCR 体系的建立 根据 GenBank 已收录的花叶病毒外壳蛋白序列设计特异性引物，选取目的片段长度分别为 CMV 489 bp、SMV 376 bp、DsMV 271 bp 的引物序列（表 1）。对反应体系 中 各 引 物 浓 度、Mg2+浓 度、dNTPs 浓 度、Taq DNA 聚合酶浓度，以及 PCR 反应程序退火温度、延伸时间、循环数进行优化。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带的亮度和清晰度。李锦超，等：半夏 3 种花叶病毒的 mRT-PCR 鉴定及遗传进化分析82第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报1.2.3多重 RT-PCR 体系灵敏度检测将 RNA 依次稀释 103、106倍，比较单重 RT-PCR 体系和多重RT-PCR 体系进行检测，电泳后检测目的条带。1.2.4 病毒外壳蛋白的基因序列比对 根据 3 种病毒 CP 序列，利用 Primer Premier 5 设计特异引物（表2）进行扩增，PCR 产物送北京中科希林生物科技有限责任公司测序。测序结果进行 Blast 比对，确认为CMV、SMV、DsMV 外壳蛋白基因序列。收集 NCBI登录的 3 种侵染病毒的外壳蛋白编码区序列，通过MEGA11.0、MEME 进行核苷酸序列比对，统计 T、C、A、G 碱基含量（AT 偏倚度=（A-T）（A+T），GC 偏倚度=（G-C）（G+C），分析序列保守域及多态性位点。分别以与 CMV 同属的花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）CP 序 列（Genbank ID：D00668），以及与 SMV