百里香酚体外抗伪狂犬病毒活性评价及其作用方式_宋天浩.pdf

浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):41 49http:/www zjnyxb cn宋天浩，庞莲凤，陈凌霜，等 百里香酚体外抗伪狂犬病毒活性评价及其作用方式J 浙江农业学报，2023，35(1):41 49DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.05收稿日期:2022-01-05基金项目:中央财政农业重大技术协同推广计划(035-2012129217);四川农业大学 2019 年学科建设双支计划(035-1921993026)作者简介:宋天浩(1997)，男，四川成都人，硕士研究生，研究方向为中西兽医结合。E-mail:1113789194 qq com*通信作者，邓俊良，E-mail:dengjl213126 com百里香酚体外抗伪狂犬病毒活性评价及其作用方式宋天浩1，庞莲凤1，陈凌霜2，邓惠丹1，徐志文1，朱玲1，任志华1，邓俊良1，*(1 四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130;2 四川省凉山彝族自治州甘洛县农业农村局 动物疫病预防控制中心，四川 甘洛616850)摘要:采用细胞体外培养技术，以 BHK-21 细胞为研究模型，探讨不同质量浓度的百里香酚在体外抗伪狂犬病毒(PRV)的活性及其作用方式。使用 CCK-8 法检测百里香酚对 BHK-21 细胞的最大无害浓度(MNTC)，计算得出其半数抑制浓度(IC50)为(212.789 1.652)gmL1，对 PRV 的半数有效浓度(EC50)为(30.710 0.303)g mL1，对 PRV 的治疗指数(TI)为 6.929，说明百里香酚属于高效低毒类抗 PRV 药物。使用 CPE观察法检测百里香酚对 PRV 病毒滴度和病毒一步生长曲线的影响，结果显示，百里香酚能够剂量依赖性显著降低 PRV 的病毒滴度，并降低 PRV 在 BHK-21 中增殖后的毒力。采用荧光定量 PCR 方法检测不同处理下 PRV感染的 BHK-21 细胞的 PRV-gE 基因的拷贝量，研究百里香酚体外抗 PRV 的作用方式，结果显示，百里香酚主要是通过抑制 PRV 在 BHK-21 细胞中的增殖来发挥抗病毒活性的，同时能够直接杀灭部分 PRV 病毒粒子。关键词:百里香酚;伪狂犬病毒;体外抗病毒活性;作用方式中图分类号:S859文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0041-09Evaluation of thymol activity against pseudorabies virus in vitro and its action modeSONG Tianhao1，PANG Lianfeng1，CHEN Lingshuang2，DENG Huidan1，XU Zhiwen1，ZHU Ling1，REN Zhihua1，DENG Junliang1，*(1 College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China;2 Animal DiseasePrevention and Control Center，Agricultural and Rural Affairs Bureau of Ganluo County，Liangshan Yi AutonomousPrefecture，Sichuan Province，Ganluo 616850，Sichuan，China)Abstract:In this experiment，BHK-21 cells were used as the research model to explore the anti pseudorabies virus(PRV)activity and action mode of thymol at different mass concentrations in vitro The maximum no-cytotoxic con-centration(MNTC)of thymol on BHK-21 cells was detected by CCK-8 method，and the half maximal inhibitory con-centration(IC50)was calculated to be(212.789 1.652)gmL1 The half effective concentration(EC50)ofthymol against PRV was determined as(30.710 0.303)g mL1and the therapeutic index(TI)of thymol was6.929，which indicated that thymol was a high-efficiency and low-toxicity anti PRV drug The effects of thymol on vi-rus titer and one-step growth curve of PRV were detected by CPE observation method The results showed that thymolcould significantly reduce the virus titer of PRV and the virulence of PRV after proliferation in BHK-21 cells in adose-dependent manner The quantitative PCR was used to detect the gene copies of PRV gE in BHK-21 cells afterdifferent treatments to study the action mode of anti PRV effect of thymol in vitro It was shown that the thymol exer-ted its antiviral activity mainly by inhibiting the proliferation of PRV in BHK-21 cells，as well as it could directly killsome PRV virus particlesKey words:thymol;pseudorabies virus;antiviral activity in vitro;action mode伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)疱疹病毒亚科(alpha-Herpesvirinae)水 痘 病 毒 属(Varicellovirus)的 成员1。我国在1950 年首次报道猪 PRV 感染。目前，PRV 感染已成为对养猪业危害最大的疾病之一2 3。国内外主要通过接种疫苗的方法来预防 PRV 感染，但该病毒拥有潜伏感染机制，会增大疫苗免疫的难度。2011 年，在我国使用 Bartha-61 疫苗免疫的猪场中发现一种新的 PRV 变种4，这就意味着需要研发新的疫苗。然而，疫苗研发始终落后于病毒的变异。目前，人用抗病毒西药在食品动物上已全面禁用。因此，寻找和开发有效的抗病毒药物是防治 PRV 感染的必要手段。牛至精油具有抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗氧化、抗炎等多种生物学活性 5 7，其中，百里香酚(thymol)是牛至精油的主要活性成分之一。研究表明，百里香酚对包括单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒(BoHV)在内的多种疱疹科病毒具有良好的抗病毒活性 7 8;然而，关于百里香酚对 PRV 的抗病毒活性目前还未见相关报道。为此，特围绕百里香酚对 PRV 的抗病毒活性，以及可能的抗病毒作用方式等开展研究，旨在评价其作为抗 PRV药物的潜力，在为猪伪狂犬病防控提供新方法的同时，也为抗疱疹病毒药物的开发提供新思路。1材料与方法1.1试验材料百里香酚(纯度 98%)，上海源叶生物科技有限公司;仓鼠肾细胞(BHK-21)、PRV，由四川农业大学生物技术中心徐志文教授惠赠;新生牛血清，内蒙古奥普赛生物科技有限公司;高糖DMEM 培养基、青链霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司;TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒(DNA 提取试剂盒)，天根生化科技(北京)有限公司;2 TaqPCR MasterMix(PCR 预混液)，北京博迈德基因技术有限公司;PrefectStartTMGreen qPCR Super-Mix(qPCR 预混液)，北京全式金生物技术股份有限公司。1.2试验仪器Forma 3111 型二氧化碳培养箱、SorvallTMST-16 台式高速离心机、Varioskan Flsah 全波长酶标仪，美国 Thermo;T100 型 PCR 仪、CFX-96 型实时荧光定量 PCR 仪，美国 Bio-Rad;DS-U3 型倒置显微镜，日本尼康公司;CJ-2F 型超净工作台，江苏苏州净化设备公司。1.3试验方法1.3.1PRV 半数组织培养物感染量(TCID50)的测定收集处于对数生长期、状态良好的 BHK-21细胞，制备均匀的细胞悬液，按每孔 100 L 的规格接种于 96 孔板中，于 37、5%CO2条件下在CO2培养箱中培养 24 h，待细胞融合度达 80%90%时接毒。使用细胞维持液(高糖 DMEM 培养基、新生牛血清、青链霉素按 98 2 1的比例混合制成)梯度稀释 PRV 病毒液(101109)，共计9 个浓度梯度，每个浓度梯度设 6 个细胞孔重复，每孔接种 100 L PRV 病毒液，于 37、5%CO2条件下在 CO2培养箱中培养 72 h，观察细胞板中的致细胞病变效应(CPE)(图 1)，使用 Reed-Muench 法(RM 法)计算病毒的 TCID50(表示病毒的滴度大小)。1.3.2无水乙醇对 BHK-21 无细胞毒性、对 PRV无抑制作用的体积分数确定以不同体积分数的无水乙醇-细胞维持液作为试验组(无水乙醇的体积分数分别为 10%、8%、6%、4%、2%)，以细胞维持液(无水乙醇体积分数为 0)作为正常对照组，在每个无水乙醇体积分数下设置 6 个重复，每孔加 100 L，于 37、5%CO2条件下培养 72 h 后弃去孔中液体，用 PBS 缓冲液洗涤3 次，然后向每孔加入110 L混合了 CCK-8 试剂的细胞维持液(细胞维持液与CCK-8 按 10 1的体积比混合)，避光、继续孵育3024浙江农业学报第 35 卷第 1 期图 1正常的 BHK-21 细胞(左)与感染 PRV 后的 BHK-21 细胞(右)的形态(200 )Fig 1Cell morphology of normal BHK-21 cells(left)and BHK-21 cells infected by PRV(right)(200 )min，使用酶标仪测定 450 nm 处的吸光值(D450)，计算细胞相对存活率，确定不会对 BHK-21 的活性产生显著影响的无水乙醇体积分数范围，并据此进行下一步试验。将病毒液与上一步确定的对 BHK-21 活性无明显影响的无水乙醇-细胞维持液进行等体积混合，使得混合液中病毒液的浓度为 TCID50的 100倍。上一步试验确定体积分数不超过 4%的无水乙醇对 BHK-21 细胞活性无明显影响，以此为基础，设计无水乙醇体积分数分别为 4%、3%、2%、1%作为试验组。同时，设置病毒对照组(CK-1E，无水乙醇体积分数为 0)和正常细胞对照组(CK-2E，仅有等体积的细胞维持液，病毒液、无水乙醇体积分数均为 0)。每组设置 6 个重复，每孔 100L，于 37、