补阳还五汤对脊髓外伤性截瘫...ak2_Jak3通路的影响_郭德华.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（）；江西中医药大学校级研究生创新专项资金项目（）作者简介：郭德华（），男（汉族），江西吉安人，江西中医药大学在读硕士研究生，主要从事中西医结合治疗脊髓损伤的相关研究工作通讯作者简介：张国福（），男（汉族），江西抚州人，江西中医药大学附属医院主任医师，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中西医结合治疗脊髓损伤的相关研究工作补阳还五汤对脊髓外伤性截瘫的治疗作用及 通路的影响郭德华，刘小舟，吴成林，许 洋，张国福（江西中医药大学，江西 南昌；江西中医药大学附属医院，江西 南昌）摘要：目的 探讨补阳还五汤对脊髓外伤性截瘫的治疗作用及 通路的影响。方法 将 只 健康清洁级大鼠随机分为 组：假手术组、模型组、模型 补阳还五汤组，分别于术后、周通过改良 评分观察其对神经功能的影响，蛋白免疫印迹法检测脊髓组织中 、蛋白表达水平。结果 与假手术组相比，模型组中改良 评分显著降低（）；与模型组相比，在第、周时，补阳还五汤干预后改良 评分显著上升，且差异具有统计学意义（）；与假手术组相比，模型组中 、的表达水平均显著上调（）；与模型组相比，补阳还五汤干预后脊髓损伤组织中的 、的蛋白表达水平均显著下调（）。结论 补阳还五汤能够减轻脊髓损伤后的炎症反应，并且通过抑制 信号通路而起到治疗脊髓外伤性截瘫的作用。关键词：补阳还五汤；脊髓损伤；蛋白酪氨酸激酶 信号转导和转录激活因子；信号通路；炎症反应 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）近年来脊髓损伤（，）的发生率在我国乃至全世界呈明显上升趋势。但目前脊髓损伤尚无有效的临床治疗措施。不仅严重影响患者的生活质量，甚至影响社会的安定。脊髓损伤的修复是目前尚未解决的医学难题，中药治疗脊髓损伤已有数千年的历史，补阳还五汤是被用于恢复脊髓损伤的神经功能的代表，但其机制却一直了解甚少。信号通路是近年来重点研究的细胞内重要的信号传递途径，与细胞凋亡和神经再生休戚相关。等报道 信号转导通路可能被 激活，而 是 细胞因子受体中的信号传导链。有研究表明，补阳还五汤可能通过抑制 通路的激活，从而减少神经元死亡，减轻神经功能缺损。另外，本研究前期研究发现，补阳还五汤对脊髓损伤后运动功能的恢复具有促进作用。因此，我们猜想补阳还五汤可通过 信号通路对、产生影响，并促进脊髓功能恢复，从而达到治疗脊髓损伤的作用。本研究采用改良 重物打击法制备脊髓损伤模型，通过改良 评分，评价补阳还五汤对脊髓损伤外伤性截瘫后行为学的影响；蛋白免疫印迹法（）检测脊髓组织中 、蛋白表达水平，探讨 信号通路在 发病中的作用及补阳还五汤治疗 的相关作用机理，现将实验结果报道如下。材料、仪器与方法 主主要要试试剂剂与与仪仪器器 补阳还五汤组成，由生黄芪（批号），当归（批号），地龙（批号），赤芍（批号），川芎（批号），桃仁 （批号），红花（批号），以上饮片均购于江西中医药大学附属医院中药房，均为江西江中中药饮片有限公司产品，经江西中医药大学附属医院中药库李晓芳副主任中药师鉴定，均符合 版中国药品质量标准。细胞裂解液（，北京普利莱基因技术有限公司）、蛋白定量试剂盒（，康为世纪）、丙烯酰胺（，）、缓冲液（）（，）、缓冲液（）（，）、十二烷基硫酸钠（）（，西陇科学股份有限公司）、过硫酸铵（）（天津市致远化学试剂有限公司）、甘氨酸（）（，）、氯化钠（）（，天津市大茂化学试剂厂）、氯化钾（）（天 津 市 致 远 化 学 试 剂 有 限 公 司）、四 甲 基 乙 二 胺（，阿 拉 丁）、（，）、膜（，）、封闭专用脱脂奶粉（，北京普利莱基因技术有限公司）、牛血清白蛋白（，索莱宝）、超敏发光液（，赛默飞）内参一抗：（，中杉金桥，）、辣根酶标记山羊抗鼠（）（，中杉金桥，）、辣根酶标记山羊抗兔（）（，中杉金桥，）、低温高速离心机（，）、数显恒温水浴锅（，郑州宏朗仪器设备有限公司）、全自动酶标仪（，北京市六一仪器厂）、蛋白垂直电泳仪（，北京市六一仪器厂）、恒温摇床（，上海领成生物科技有限公司）、全自动样品快速研磨仪（，上海净信实业发展有限公司）、超高灵敏度化学发光成像系统 ，伯乐生命医学产品（上海）有限公司。实实验验动动物物与与分分组组 大鼠 只采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证编号：（湘），雌性，周龄，饲养于洁净环境中，温度（），湿度 ，自由饮食摄水，小时光暗交替，所有动物适应性喂养 天后开始正式试验。随机分为 组：假手术组（），模型组（）、模型组 补阳还五汤组（）。脊脊髓髓损损伤伤模模型型的的建建立立 所有动物适应性喂养 天后开始正式试验，造模采用 重物打击法制作脊髓损伤模型，具有保持硬膜完整性，造成大鼠脊髓重度损伤致完全性截瘫。术后将动物置于保温垫上直至苏醒。假手术组造模：只暴露第 胸椎段脊髓，不撞击该段脊髓，避免大鼠出现脊髓打击伤，依次缝合肌肉、皮肤，关闭切口。补补阳阳还还五五汤汤的的制制备备 采用补阳还五汤，根据中华人民共和国药典制定剂量范围内的临床常用剂量称取中药材，药物组成 时珍国医国药 年第 卷第 期如下：川芎，芍药，生黄芪，地龙，桃仁，当归，红花。按照中药煎药规定，将药汤浓缩至 备用，相当于临床等效药物浓度 。术术后后给给药药 空白对照组行生理盐水灌胃；补阳还五汤按照每次 动物体重进行灌胃给药，每天进行两次灌胃，自动物苏醒后连续敷药（周分别灌胃 次）。术后大鼠被置于垫有锯末的平板动物笼中，避免肢体或骶部压疮及吸收排尿。行行为为学学观观察察 采用双盲、双人独立观察记录，在术后 周进行行为学评分观察，采用改良 评分。改良 评分 和 分：没有自主性的运动，只限于非反射性的髋、膝关节运动；分：髋、膝、踝三个关节的肢体运动；分：行走时可主动支撑体重和不协调步态或偶尔出现协调步态；分：活动时呈现前后肢协调步态，行动时有趾间关节的肢体运动；分：正常步态。检检测测 取待检组织样本，参照 试剂盒测定蛋白浓度。先将蛋白变性，上样，进行 凝胶电泳 ，后润湿法转膜 。一抗原液孵育在 的温度下过夜；二抗原液在室温下孵育 。在 膜上滴加 曝光液，用“”软件分析各抗体条带灰度值。统统计计学学方方法法 实验结果应用 软件进行统计分析。数据结果采用?表示。两组之间定量数值比较采用独立样本 检验。以 为差异有统计学意义。结果 脊脊髓髓损损伤伤大大鼠鼠治治疗疗前前后后改改良良 评评分分结结果果 与假手术组相比，模型组中改良 评分显著降低（）；与模型组相比，在第、周时，补阳还五汤干预后改良 评分显著上升，且差异具有统计学意义（）。见表。表 各组大鼠损伤后改良 评分结果（?）组别 周 周 周假手术组 模型组 ）模型组 补阳还五汤组 ）与假手术组相比，）；与模型组相比，）；脊脊髓髓损损伤伤后后 信信号号通通路路相相关关因因子子的的表表达达 检测在大鼠脊髓损伤组织中 、蛋白的表达水平，与假手术组相比，模型组中 、的表达水平均显著上调，差异有显著统计学意义（）。见表，图。表 脊髓损伤后 信号通路相关因子的表达（?）指标时间 周模型组假手术组 值 ）与假手术组相比，）；与模型组相比，）；脊脊髓髓损损伤伤后后相相关关因因子子的的表表达达 检测在大鼠脊髓损伤组织中、蛋白的表达水平，与假手术组相比，模型组中、的表达水平均显著上调，差异有显著统计学意义（）。见表，图。补补阳阳还还五五汤汤对对脊脊髓髓损损伤伤后后 信信号号通通路路相相关关因因子子的的表表达达 检测在大鼠脊髓损伤组织中 、蛋白的表达水平，与假手术组相比，模型组中 、的表达水平均显著上调（），而补阳还五汤干预又能抑制这些蛋白的表达，且差异具有显著统计学意义（）。见表，图。图 各组大鼠脊髓损伤后 、蛋白表达表 脊髓损伤后相关炎症因子的表达（?）指标时间 周模型组假手术组 值 ）与假手术组相比，）；与模型组相比，）；图 各组大鼠脊髓损伤后、蛋白表达表 补阳还五汤对脊髓损伤后 信号通路相关因子的表达（?）指标时间 周模型组 补阳还五汤模型组假手术组 值 ）与假手术组相比，）；与模型组相比，）；图 补阳还五汤对脊髓损伤后 、蛋白表达的影响 补补阳阳还还五五汤汤对对脊脊髓髓损损伤伤后后相相关关因因子子的的表表达达 时珍国医国药 年第 卷第 期 检测在大鼠脊髓损伤组织中、蛋白的表达水平，与假手术组相比，模型组中、的表达水平均显著上调（），而补阳还五汤干预又能抑制这些蛋白的表达，且差异具有显著统计学意义（）。见表，图。表 补阳还五汤对脊髓损伤后相关炎症因子的表达（?）指标时间 周模型组 补阳还五汤模型组假手术组 值 ）与假手术组相比，）；与模型组相比，）；图 补阳还五汤对脊髓损伤后、蛋白表达的影响 讨论随着现代社会交通、工业的不断发展，脊髓损伤的发病率正呈现逐年增高趋势，脊髓损伤后可造成严重并发症。因此，脊髓损伤的治疗与干预措施是当今基础和临床研究的热点之一。目前研究发现，脊髓损伤可能与 信号通路有关，而补阳还五汤可以通过抑制 信号通路中相关蛋白的表达，减少、炎症因子的反应，从而改善脊髓功能，但目前对于该方面的研究不够系统全面，急需完善的实验研究予以探究。在本实验研究结果中发现，与假手术组相比，模型组中改良 评分显著降低（），其运动功能急剧下降；大鼠脊髓损伤组织中 、的表达水平均显著增加（），这表明大鼠脊髓外伤性截瘫行后 信号通路被激活。究其原因，作为炎症细胞分化的重要影响因子，而 作为 等多种细胞因子的信号传导链，参与了神经神经系统的调节过程及急性脊髓损伤的继发性损害，；而在神经系统方面，、也是起关键作用的蛋白，抑制 信号通路激活，可明显减缓大鼠因的神经组织损伤，抑制神经细胞凋亡，促进神经功能恢复。因此本实验探究了大鼠脊髓损伤组织中炎症因子的表达，发现脊髓损伤组织中、的表达显著增加（），这表明大鼠脊髓损伤后发生严重的炎症反应，并且与 信号通路相关。另外，目前研究认为，补阳还五汤作为治疗脊髓损伤的中药复方方剂，具有多组分、多靶点和多途径协同作用神经再生，可能会提供更有利于神经生长的环境，且中药毒副作用少，价格更经济，更能被患者所接受，但对于补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用机制并不十分明确。近几年多位学者通过实验研究发现，补阳还五汤有改善脊髓缺血状态、抑制炎症反应、减少细胞凋亡，促进功能脊髓恢复等作用。尤其是有研究证明补阳还五汤在体外和体内可上调 信号的表达，促进缺血后大脑海马的神经兴奋。因此，我们猜想补阳还五汤可通过对 信号通路产生影响，从而达到治疗脊髓损伤的作用。本实验通过补阳还五汤灌胃，探究补阳还五汤干预脊髓损伤后 信号通路及其相关炎症因子表达的影响。实验结果显示，与模型组相比，在第、周时，补阳还五汤干预后改良 评分显著上升（），其运动功能显著恢复；补阳还五汤干预后脊髓损伤中的 、的蛋白表达水平均显著下调（），这表明补阳还五汤干预后能显著抑制 信号通路的激活。此外，补阳还五汤干预后能显著抑制脊髓损伤组织中、的蛋白表达，这表明大鼠脊髓损伤后发生严重的炎症反应，而补阳还五汤能够抑制 信号通路介导的炎症反应。综上所述，补阳还五汤能够减轻脊髓损伤后的炎症反应，并且通过抑制 信号通路而起到治疗脊髓外伤性截瘫的作用。参考文献：，：，（）：田 婷，李晓光 脊髓损伤再生修复中的问题与挑战 中国组织工程研究，（）：，（）：，（）：，（）：，；（）：，：，（）：，（）：王凯华，任丁，黄龙坚 补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注后 的影响 陕西中医，（）：林晓敏，潘伟滨，吴玉琼，等 补阳还五汤对脊髓损伤后型胶原蛋白和型胶原蛋白表达的影响 中国组织工程研究，（）：王庆锋，梁学刚，刘学起 信号通路在脊髓损伤中的作用 中国矫形外科杂志，（）：彭 成，刘佩雷，陶钧，等 急性脊髓损伤后炎症反应、自噬和凋亡相关因子的变化以及 信号通路研究 转化医学杂志，（）：贺 丰，穆晓红，付玲玲 脊髓损伤的中医研究现状 世界中西医结合杂志，（）：张 晔，李 媛，史文心，等 脊髓损伤急性期 的表达及其动态变化 中国实用医药，（）：李 菁，朱 磊，林浩东，等 心脏营养素 对大鼠损伤脊髓的保护作用 第二军医大学学报，（）：，时珍国医国药 年第 卷第 期