八宝丹阻滞人结肠癌细胞周期抑制结肠癌细胞生长_方翌.pdf

福建中医药 2023 年 1 月 第 54 卷 第 1 期Fujian Journal of TCM January 2023，54（1）八宝丹阻滞人结肠癌细胞周期抑制结肠癌细胞生长方翌1，2，3，郭旭鸿4，魏丽慧1，2，朱洁4，沈阿灵5，林久茂3，6，7*（1.福建中医药大学科技创新与转化中心，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院&中西医结合研究院临床研究所，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；4.福建中医药大学药学院，福建 福州350122；5.福建中医药大学科学技术处，福建 福州 350122；6.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；7.福建省高校中西医结合基础重点实验室，福建 福州 350122）摘要：目的探究八宝丹（BBD）对结肠癌细胞HCT116生长及周期的影响。方法体外培养结肠癌细胞HCT116，将细胞分为0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1 mg/mL组、2 mg/mL组，分别以不同浓度（0、0.5、1、2 mg/mL）BBD干预24 h。显微镜下观察细胞密度及形态；台盼蓝染色法检测细胞数量；MTT法检测细胞活力；集落实验检测细胞增殖能力；周期实验检测BBD对HCT116细胞周期的影响；Q-PCR法检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）的mRNA水平；Western blot法检测Cyclin D1、CDK4的蛋白表达。结果BBD抑制结肠癌细胞生长；BBD 抑制结肠癌细胞的活力；BBD 抑制结肠癌细胞增殖；BBD 阻遏细胞周期于 G0/G1 期；BBD 下调 HCT116细胞当中 CDK4和 Cyclin D1的 mRNA 水平；BBD 抑制 CDK4和 Cyclin D1的蛋白表达水平。结论BBD下调HCT116细胞中Cyclin D1、CDK4的表达水平，阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制结肠癌细胞生长。关键词：结肠癌；八宝丹；增殖；细胞周期；Cyclin D1；CDK4结直肠癌是一种常见的消化道恶性疾病，在世界范围内的发病率和致死率分别排第三和第二1。结肠癌患者常伴随着脏腑、组织、机体等方面的严重损伤，若在患病早期进行科学、有效地治疗，能在一定程度上提高患者的生存率2。近年来，随着恶性肿瘤的治疗理念发生变化，中药对癌症的防治效果日益明显，尤其是对癌症的转移、复发有较大的抑制作用，87%的肿瘤患者采用了中西医结合的治疗方案3。八宝丹（BBD）是我国传统中医方剂之一，其主要成分包括麝香、三七、蛇胆、牛黄、珍珠、羚羊角，具有清热凉血、清肝解毒、消肿止痛的功效。研究显示，八宝丹具有术后辅助肿瘤治疗的作用4，其抗肿瘤机制主要通过抑制肿瘤细胞生长5、调控肿瘤细胞周期6、诱导肿瘤细胞凋亡7等方面发挥作用。然而其在抗结肠癌的基础研究还尚少。因此，本课题通过体外实验，探究八宝丹对结肠癌细胞生长的影响，以期为结肠癌的防治进一步提供重要的实验依据。1实验材料1.1实验细胞与药物人结肠癌细胞 HCT116，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，保存于液氮罐中。八宝丹购自厦门中药厂（批号：180901）。1.2实验试剂PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 TaKaRa 公司）；Trizol、PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix、RNase Staining Solution（美国Thermo Fisher Scientific公司）；细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）一抗和兔二抗（美国 CST 公司，批号：E3P5S、D9G3E）Super ECL Star特超敏化学发光检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；McCoys 5A不完全培养液（江苏凯基生物技术股份有限公司）。1.3实验仪器CFX96 touch（美国Bio-Rad公司）；Countstar tigel 53自动细胞计数仪（中国睿钰生物科技有限公司）；倒置显微镜（德国Leica公司）；Multiskan FC多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；流式细胞仪Facscelesta（美国BD公司）。2实验方法2.1八宝丹药液配制将 BBD 药粒碾成粉末，溶解于 PBS 溶液，配制成浓度为 25 mg/mL 的母液，30 min 超声溶解，高压灭菌后分装于 1.5 mL 的 EP管，存于4 冰箱备用。2.2分组及干预用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的McCoys 5A不完全培养液培养细胞，实验设置4个分组（0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1 mg/mL组、2 mg/mL 组），按 1105个/mL 浓度分别接种于96 孔板和 6 孔板中，贴壁过夜后以不同浓度 BBD（0、0.5、1、2 mg/mL）干预24 h。2.3MTT 实验待测细胞每孔加入 100 L 的 1收稿日期：2022-06-14基金项目：福建省自然科学基金项目（2019J01355）；福建中医药大学横向课题（HX2021011）通信作者：林久茂，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0100725福建中医药第 54 卷MTT（9 mL PBS1 mL MTT溶液），培养箱中孵育4 h后去原液，加入 100 L DMSO，振荡 2 min 后于450 nm波长处测定OD值。2.4集落形成实验将BBD干预后的细胞用胰酶消化，按500个/孔浓度转接于12孔板中，各组均设3个重复。每隔2 d换液，培养1周后，PBS清洗2次后晾干，多聚甲醛固定 15 min后清洗晾干，结晶紫染色15 min后清洗、拍照并计数。2.5周期实验将BBD干预后细胞消化，轻柔吹打细胞，使细胞成单个悬浮状态而不成团。细胞离心去上清，PBS 清洗 2 次后以预冷的 70%乙醇溶液重悬细胞，4 固定过夜。再以 PBS 清洗 2 次后，RNase Staining Solution染色30 min后流式细胞仪上机检测。2.6Q-PCR 法将 BBD 干预后细胞以 Trizol 法提取总RNA，逆转录合成cDNA，八联管中制备Q-PCR反应体系，CFX touch 检测 CT 值，并采用 2-Ct法计算其表达水平的变化倍数。2.7Western Blot 法收集细胞，加入适量 RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度，计算上样量。蛋白在100 的金属浴中变性10 min，经 SDS-PAGE 电泳、转膜、5%牛奶封闭 1 h后一抗（4 过夜）、二抗孵育、显影并进行灰度值分析。2.8统计学方法采用SPSS 16.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（x s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.14 组细胞形态及存活率比较不同浓度 BBD（0、0.5、1、2 mg/mL）干预HCT116细胞24 h后，显微下观察发现，细胞密度随着 BBD 浓度的增加而逐渐下降。台盼蓝染色计数法结果显示，经 BBD 干预后，细胞存活率显著下降（P0.01）。见图1。3.24组细胞活力比较与 0 mg/mL 组比较，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干预HCT116细胞24 h后，HCT116细胞的细胞活力显著下降（P0.01），见图2。3.34组细胞集落形成情况比较与0 mg/mL组比较，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干预后的 HCT116细胞集落形成数量显著减少（P0.05），以2 mg/mL的BBD对集落形成数量的抑制作用最强（P0.01），见图3。3.44组细胞周期情况比较与0 mg/mL组比较，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干预 HCT116 细胞 24 h 后，HCT116 细胞 G0/G1 期比例显著增加（P0.05），1 mg/mL组周期抑制作用增强（P0.01），S期比例显著下降（P0.05），见图 4，表明 BBD阻遏细胞周期于G0/G1期。3.54组细胞CDK4和Cyclin D1基因水平比较与0 mg/mL组比较，2 mg/mL 组 CDK4、Cyclin D1 的基因水平明显被抑制（P0.05，P0.01），见图 5，提示高浓度的 BBD 显著抑制 CDK4 及 Cyclin D1 的转录表达水平。3.64组细胞CDK4和Cyclin D1蛋白表达比较与0 mg/mL组比较，2 mg/mL 组 CDK4、Cyclin D1 的蛋白相对表达量明显下降（P0.05，P0.01），见图6，提示高浓度的 BBD 显著抑制 CDK4 及 Cyclin D1 的蛋白表达。注：与 0 mg/mL组比较，1）P0.01。图 1 4组细胞形态及存活率比较（100）注：与 0 mg/mL组比较，1）P0.01。图 2 4组细胞活力比较26方翌 等：八宝丹阻滞人结肠癌细胞周期抑制结肠癌细胞生长第 1 期4讨论结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，常用治疗手段为手术切除病理部位并辅以放疗、化疗，其临床表现多为腹部不适，出现腹部肿块，且伴随消瘦、无力等全身症状8。中医学认为结肠癌与“癌毒”入侵、“正气”衰弱密切相关，多数结肠癌患者伴随气滞、痰湿、血瘀、热毒9，而中药则可以通过直接提升“正气”来祛除病邪，或通过补脾、补肾、补益气血、清热解毒等方式间接抵抗毒邪侵袭，用于癌症治疗具有良好的增效减毒功能10。BBD主药麝香、三七、牛黄均具有一定的抗肿瘤作用11-13，诸药合用具有显著的活血止痛、清热解毒的功效，具有抗炎、抗肿瘤的作用，在临床上常用于免疫性疾病、血液病、中医湿热毒瘀证等方面的治疗4。前期研究发现 BBD能通过调控细胞周期抑制肿瘤细胞生长14，提示 BBD 可能通过阻碍细胞周期进程来抑制结肠癌细胞生长。细胞周期调控细胞生长的全过程，其正常运行是保证细胞正常生长繁殖的必要条件。若其调控机制紊乱，细胞异常增殖，最终会导致肿瘤的发生。本研究采用流式细胞技术检测 BBD对结肠癌细胞周期的影响，结果发现 BBD 能阻滞结肠癌细胞于G0/G1阶段，提示其能通过抑制细胞周期来抑制结肠癌细胞的过度增殖。注：与 0 mg/mL组比较，1）P0.05，2）P0.01。图 3 4组细胞集落形成情况比较注：与 0 mg/mL组比较，1）P0.05，2）P0.01。图 4 BBD 对结肠癌细胞周期分布的影响注：与 0 mg/mL组比较，1）P0.01，2）P0.05。图 5 4组细胞 CDK4和 Cyclin D1基因水平比较27福建中医药第 54 卷在细胞周期进程中，细胞周期蛋白（Cyclin）常与细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）结合成复合物，从而调控细胞周期。CDK4是CDK家族的一员，已被确认是一种与良恶性肿瘤疾病相关的癌基因，在多种肿瘤细胞中异常表达，能为早期诊断肿瘤提供可能15。Cyclin家族中Cyclin D与肿瘤的发生、发展关系最为紧密，Cyclin D1在其中具有重要的地位，其表达下调可缩短G1期，阻碍细胞生长进程，相反其高表达具有推进癌细胞进展的作用16。Cyclin D1在细胞 G1 阶段的早期表达增强，它能与 CDK4 结合，并通过Cyclin/CDK4途径跨越G1调节点，是G1至 S 期的主要调节因子17。在细胞周期中，G1/S期为细胞内外信号在细胞核中聚集的关键调节点，具有调控细胞增殖的作用，故其调控机制紊乱可诱发癌症18。据报道，CDK4和Cyclin D1的过表达是结肠癌的特征之一18，本研究结果显示，BBD抑制Cyclin D1和CDK4的基因水平和蛋白表达，阻遏细胞于 GO/G1 期，提示了 BBD 可能通过调控 Cyclin D1/CDK4抑制结肠癌细胞生长。参考文献1BRAY F，FERLAY J，SOERJOMATARAM I，et al.Global cancer statist