变色栓菌来源漆酶的酶学性质及对染料脱色性能的研究_邢宇.pdf

研究论文2023年第42卷第1期食品与生物技术学报邢 宇，等：变色栓菌来源漆酶的酶学性质及对染料脱色性能的研究Study on Enzymatic Properties of Laccase Derived from Trametes versicolorand Its Decolorization of DyesXING Yu，WANG Tianyu，CHEN Xiaoyi，LI Miao，WANG Shujing，LI Qian*，LI Xianzhen(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034，China)Abstract：Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase,which can catalyze the oxidation ofvarious phenolic compounds and aromatic amines.It has wide application prospects in food,paper,energy,macromolecular compound synthesis and other fields.In recent years,more and moreattention has been focused on the development and utilization of laccase.In this study,during thefermentation via Trametes versicolor in flasks,the morphology of mycelium was induced andregulated by adding farnesol,and the yield of laccase was increased.Besides,the activity of laccasefermented from Trametes versicolor and the mass concentration of protein reached(161.371.58)U/L and(29.191.30)mg/L,respectively,which was more than ten times higher than those of thecontrol group.In addition,the optimum reaction temperature was 40,the optimum pH was 4.0,and the laccase had good thermal stability in the range of 2555.Furthermore,based on the studyof enzymatic reaction kinetics,it was found that laccase had a certain decolorization effect on evansblue,congo red,and eriochrome black T dyes,and the decolorization effect of evans blue was thestrongest,exhibiting good application potential.Keywords:laccase,Trametes versicolor,enzymatic properties,dye decolorization摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能催化多种酚类化合物和芳香族胺氧化，在食品、造纸、能源、高分子化合物合成等领域有着广阔的应用前景。近年对于漆酶的开发利用逐渐受到重视，作者在变色栓菌摇瓶发酵过程中，通过加入法尼醇诱导调控菌丝形态以提高漆酶产量，结果表明，变色栓菌发酵获得的漆酶酶活力和蛋白质质量浓度分别达到（161.371.58）U/L和（29.191.30）mg/L，均比对照组提高了10倍以上，其最适反应温度为40，最适pH为4.0，且在2555 有较好的热稳定性。进一步在酶促反应动力学研究基础上，发现漆酶对伊文思蓝、铬黑T、刚果红3种染料均有一定的脱色效果，其中对伊文思蓝的脱色能力最强，具有较好的应用潜力。关键词：漆酶；变色栓菌；酶学性质；染料脱色性能中图分类号：Q 814.2文章编号：1673-1689（2023）01-0075-08DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2023.01.006变色栓菌来源漆酶的酶学性质及对染料脱色性能的研究邢 宇，王添誉，陈晓艺，李 苗，王淑婧，李 佥*，李宪臻（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连116034）收稿日期：2022-04-08基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31601411,22108024）；辽宁省教育厅科学研究项目（J2020043）。*通信作者：李 佥（1982），女，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事食品酶的发酵、制备和酶学性质研究。E-mail：研究论文75RESEARCH ARTICLEXING Yu，et al：Study on Enzymatic Properties of Laccase Derived fromTrametes versicolor and Its Decolorization of DyesJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023漆酶是降解多酚类物质的关键酶之一，其能够催化多种酚类、芳香族有机物形成自由基，形成的自由基能够发生聚合或解聚等非酶促次级反应，并且以氧原子为最终受体，产物为水，无其他有害产物。自1883年日本学者首次从日本紫胶漆树中发现漆酶以来1，漆酶在食品、造纸、纺织、环保等领域逐渐引起了越来越多的关注2-3。目前，已发现的漆酶种类众多，按照来源可以分为植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶4。其中，对真菌来源漆酶的研究数量最多，真菌漆酶主要由担子菌和子囊菌产生，常用的菌株是白腐菌和变色栓菌。变色栓菌是典型的担子菌门真菌，分布在全国21个省份，分泌漆酶的能力较强，且生长速度快，易于培养，并且在降解木质素和染料脱色方面表现出优异的性能，有着极大的工业应用价值5。李灵灵等筛选分离了一种高效降解木质素的菌株BYL-7，并发现了在初始pH 6.7、温度25、接种量8%（体积分数）的条件下可明显提高其木质素降解率6。Asgher等发现一种当地白腐真菌IBL-04，通过优化温度和pH等工艺参数，这种真菌处理纺织工业废水的脱色率在3 d内显著提高到了84%7。法尼醇是一种低水溶性的非环状半萜醇，被广泛用作化妆品和抗癌药物的原料，是目前发现的真菌中研究最多的群体感应因子8-11。胡建华在5 L发酵罐中加入法尼醇改变了变色栓菌的菌丝形态，提高了漆酶的产量，在法尼醇添加浓度为60 mol/L时，漆酶产量比对照组提高了93%12。在以往的研究中，尚未有关于以法尼醇作为信号分子诱导的变色栓菌发酵体系所产生的漆酶的酶学性质研究，并且对该体系中产生的漆酶在染料脱色方面的探索较少。作者以土豆培养基为基质，利用变色栓菌进行漆酶的发酵生产，发酵过程中采用法尼醇作为诱导剂13，测定了漆酶酶活力和蛋白质质量浓度，进一步研究了漆酶的酶学性质和酶促反应动力学。研究其对伊文思蓝、铬黑T、刚果红3种染料的脱色效果，为揭示漆酶的催化机制提供了基础数据，同时也为进一步深入探索漆酶的催化机制和对漆酶分子在蛋白质水平上进行改造以获得具有工业应用价值的漆酶提供了数据支持。1.1实验菌株变色栓菌（Trametes versicolor，编号CICC14001）：中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。1.2实验试剂邻苯二酚：上海阿拉丁试剂有限公司产品;酒石酸、酒石酸钠：国药集团化学试剂有限公司产品;法尼醇：合肥博美生物科技有限责任公司产品;磷酸二氢 钾、CaCl22H2O、MgSO47H2O、NH4H2PO4、FeSO47H2O、葡萄糖、CuSO45H2O：天津市科密欧化学试剂有限公司产品;CaCl22H2O、MgSO47H2O、NH4Cl：天津市大茂化学试剂厂产品;考马斯亮蓝G250：鼠来宝（武汉）生物科技有限公司产品;刚果红、铬黑T、伊文思蓝：上海源叶生物科技有限公司产品;以上试剂均为分析纯（AR）。1.3主要设备电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；立式高压蒸汽灭菌锅：浙江力辰仪器科技有限公司产品；SpectraMax Plus384酶标仪：上海仪电科学仪器股份有限公司产品；紫外-可见分光光度计：铂金埃尔默仪器有限公司产品；微生物培养箱：杭州坤天科技有限公司产品；BILON超声波清洗机：上海比朗仪器制造有限公司产品；PHSJ-3F型pH计：上海雷磁仪器有限公司产品；TDZ5-WS台式低速离心机：上海三崴医疗设备有限公司产品；热风循环烘箱：吴江华飞电热设备有限公司产品；XY-SYG-11恒温水浴锅：上海昕仪恒温水浴锅公司产品；全温型多振幅高速轨道摇床：上海智城分析仪器厂产品。1.4菌种培养方法1.4.1斜面活化配制土豆培养基，称取去皮土豆200 g，加入适量去离子水，煮沸30 min，纱布过滤后定容至1 L，然后加入葡萄糖20 g、琼脂粉15 g，加热融化后分装至试管中，经121、20 min高温灭菌后制成斜面，将菌接种在斜面上26 培养7 d。1.4.2种子扩培配制土豆培养基，称取去皮土豆200 g，加入适量去离子水，煮沸30 min，纱布过滤后定容至1 L，再加入葡萄糖20 g，搅拌至溶解，分装至250 mL三角瓶中（100 mL/瓶）。将斜面菌丝体接种到种子培养基中，26、150 r/min培养7 d，即形成一级种子培养液；再将一级种子培养液接种到新鲜的种子培养基中，接种量为10%（体积分数），26 培养5 d，即形成二级种子培养液。1.4.3摇瓶发酵发酵培养设置两组，分别为常规发酵体系（即不添加法尼醇的对照组）与以法尼醇材料与方法176研究论文2023年第42卷第1期食品与生物技术学报邢 宇，等：变色栓菌来源漆酶的酶学性质及对染料脱色性能的研究为诱导剂的变色栓菌发酵体系。常规发酵体系的发酵培养基配方为：1 L培养基中含KH2PO40.2 g、CaCl22H2O 0.1 g、MgSO47H2O0.05 g、NH4H2PO40.5 g、FeSO47H2O0.035 g、葡 萄 糖2 g、NH4Cl0.27 g、CuSO45H2O 0.02 g，充分溶解后，分装至250 mL三角瓶中（50 mL/瓶），随后将二级种子培养液（菌球状培养物）接种于发酵培养基中，26、150 r/min培养7 d，接种量为10%（体积分数），发酵前期pH控制在4.0左右。法尼醇为诱导剂的变色栓菌发酵体系则是在接种前将法尼醇经0.22 m无菌滤膜过滤添加到常规发酵培养基中，浓度为4 mmol/L13，26、150 r/min培养7 d，诱导漆酶发酵过程。1.5酶活力测定向10 mL离心管中加入3 mL 0.1 g/dL邻苯二酚溶液和适量漆酶发酵液，在25 下反应5 min，随后利用紫外-可见分光光度计测定450 nm处的吸光度，已知摩尔吸光系数为2 211 L/（molcm），漆酶酶活力的计算公式如下式（1）：E=（A测-A0）V总V酶t106（1）式中：E为酶活力，U/L；V酶为漆酶溶液体积，mL；V总为该反应体系总体积，mL；A测为酶液反应后吸光度；A0为酶液未反应前吸光度；t为反应时间，min；为摩尔吸光系数，L/（molcm）。酶活力定义为：1 min氧化1 mol邻苯二酚所需漆酶的量为一个酶活力单位（U）。实验结果为3个平行实验的平均值。1.6蛋白质质量浓度测定1.6.1制作BSA标准曲线根据Bradfor