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细辛
剥夺
复糖
损伤
保护
作用
机制
研究
卢志刚
书书书论著 :网络首发 :()细辛醚对氧糖剥夺 复糖复氧诱导星形胶质细胞损伤的保护作用及机制研究卢志刚,卢青,丁运宇,高志远(湖北民族大学附属荆门市第一人民医院神经内科,湖北荆门 )摘要目的探讨石菖蒲有效成分细辛醚对氧糖剥夺复糖复氧损伤星形胶质细胞的保护作用及机制。方法将星形胶质细胞分为组:对照组、模型组、细辛醚()组、核因子 相关因子()抑制剂(,)组、细辛醚()()组。检测细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡水平,以 法检测细胞内活性氧()水平,试剂盒检测细胞氧化应激因子 谷胱甘肽过氧化物酶()、乳酸脱氢酶()、丙二醛()及超氧化物歧化酶()及炎症因子 核因子 亚基 ()、白细胞介素()和 的水平,实时荧光定量 ()检测 、血红素氧化酶()的表达水平,检测 、醌氧化还原酶()、蛋白表达。结果与对照组比较,模型组、组及细辛醚 组细胞凋亡率、和 水平明显升高,细胞存活率、明显下降()。与模型组比较,细辛醚组及细辛醚 组细胞凋亡率、和 明显下降,、明显升高,组上述指标则相反()。与 组比较,细辛醚组及细辛醚 组细胞存活率、明显下降,、明显升高()。结论细辛醚可能通过激活 通路减轻氧糖剥夺复糖复氧诱导的星形胶质细胞氧化应激及炎症损伤以起到保护作用。关键词细辛醚;脑缺血再灌注损伤;氧化应激;炎症反应;星形胶质细胞 中图法分类号 文献标识码 文章编号 (),(,),:,(),()(,),()(),()(),(),()()(),(),()(),(),(),重庆医学 年月第 卷第期基金项目:湖北省自然科学基金面上项目();湖北省卫生健康委员会面上项目();湖北省荆门市科技计划重点项目()。作者简介:卢志刚(),主任医师,硕士生导师,博士,主要从事脑血管病基础与临床研究。,(),();脑血管病已成为危害健康的重要疾病,具有较高的发生率、复发率、致残率和死亡率。约 的脑卒中是由大脑动脉闭塞引起的缺血性脑卒中。缺血性卒中导致了大脑缺血区域的细胞功能障碍及细胞死亡。通过再灌注恢复血液供应可以挽救缺血组织,但再灌注本身会造成组织损伤,称为脑缺血再灌注损伤()。缺血卒中区域的再灌注和血供的恢复往往会导致一系列的细胞生化后果,的病理机制包括过度活性氧()的产生、细胞氧化损伤、炎症级 联 反 应 的 激 活 及 再 灌 注 组 织 中 细 胞 凋 亡 的 诱导。目前,静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂()和血管内治疗已被广泛应用于临床,并已证明可降低致残风险。然而,这些治疗方法可能在加重神经元死亡的同时也加重神经功能障碍。探索脑损伤的机制,寻找减轻 的药物已成为脑缺血治疗的重点。中药在这方面发挥着独特的作用,主要体现在抗氧化和病理损伤、减少兴奋性氨基酸的神经毒素、清除自由基、减少钙超载、影响血小板和血栓形成、调节凋亡等。石菖蒲的有效活性物质细辛醚能有效改善 ,与抑制炎性反应、减轻氧化应激、改善能量代谢、降低细胞兴奋性毒性及保护血脑屏障等作用机制关系密切。然而,细辛醚的作用机制尚未完全阐明。星形胶质细胞介导的炎症和氧化应激在急性缺血性脑卒中后引起了 。本实验采用星形胶质细胞氧糖剥夺()复氧复糖()损伤模拟构建 体外模型,观察细辛醚对星形胶质细胞的神经保护作用,为进一步探讨 的机制和脑保护机制提供有价值的思路,现报道如下。材料与方法材料实验动物周龄的 只雄性 小鼠,体重 ,购自华中科技大学实验动物中心()。主要药品与试剂细辛醚对照品(美国 公司,纯度,货号:)。胎牛血清、高糖培养基(美国 公司,批号分别为 、)。谷胱甘肽过氧化物酶()、乳酸脱氢酶()、丙二醛()及超氧化物歧化酶()检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司,批号分别为 、)。小 鼠 核 因 子 亚基 ()、白 细 胞 介 素()、试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号分别为 、)。实时荧光定量聚合酶链反应()试剂、合成试剂(美国 公司,批号分别为 、)。多克隆抗体、醌氧化还原酶()多克隆抗体、血红素氧化酶()多克隆抗体、多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、抑制剂,二氢(甲基苯甲酰)吲哚基甲 基噻 唑 基,苯 并 二 氧 唑乙 酰 胺()、活 性 氧 荧 光 探 针()试 剂 盒、试剂盒(美国 公司,批号分别为 、)。膜 联 蛋 白()双染细胞凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,批号 )。主要仪器 型细胞培养箱、实时荧光定量 仪(美国 公司);型流式细胞仪(美国 公司);全 自 动 酶 标 仪(美 国 公 司);型凝胶成像系统(北京六一生物科技有限公司);超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);倒置相差显微镜(日本 公司)。方法星形胶质细胞的分离培养 取出乳鼠 冰冻麻醉,乙醇消毒,无菌磷酸盐缓冲液()清洗后分离脑组织,加入 培养基洗涤,分离出大脑皮质,剪碎后胰蛋白酶消化,孵育过筛,加入 液洗涤离心,弃上清液得细胞团。与培养液混合后,接种到包被多聚赖氨酸后的细胞培养板中,种板后换液继续培养。后摇床下分离出星形胶质细胞,经 免疫荧光鉴定确认。体外模型的建立 及分组处理将星形胶质细胞分为组:对照组、模型组、细辛醚()组、()组、细辛醚()()组。体外重庆医学 年月第 卷第期模型的构建:纯化后的原代星形胶质细胞在正常培养条件下,种板培养融合率在 时去除原培养基,洗涤细胞次,换成无血清无糖培养液,在含 氮气及二氧化碳的培养箱内 培养,随后更换为含 胎牛血清的 培养基。细辛醚组、组、细辛醚 组分别加入 细 辛 醚、及 细辛醚 ,放在含二氧化碳及 空气的培养箱内 培养。对照组一直在含糖含氧环境中培养,模型组仅予以 处理。法检测细胞存活率组细胞按照方法处理后接种到 孔板内,每孔内加入 溶液,在、二氧化碳的培养箱内继续孵育,未接种细胞的孔为空白凋零孔,采用全自动酶标仪在 处测定吸光度()值,计算细胞存活率。细胞存活率实验组值空白组值 。二硝基苯肼法检测 漏出率组细胞按照方法处理后,分别收集各组细胞及其上清液,细胞被超声破碎为匀浆,按照 检测试剂盒严格检测上清液和细胞匀浆中 的值,计算 漏出率。漏出率上清液中值(上清液 值细胞匀浆中 值)。流式细胞术 测定细胞凋亡水平组细胞按照方法处理后,用冷 清洗处理过的细胞,加入胰酶室温消化,取细胞悬浮液离心,弃上清液后收集细胞。细胞 重悬后再次离心弃上清液,加入缓冲液悬浮细胞后严格按照试剂盒步骤加入 抗体及 染料进行染色,然后采用流式细胞仪进行检测。星形胶质细胞氧化应激水平的检测,二氯荧光素二乙酸酯()法检测 的表达严格按试剂盒说明书要求操作。细胞于无血清培养基稀释 至终浓度为 ,吸走培养基,加入 至终浓度为 ,培养箱内孵育 ,用无血清培养基洗涤细胞,胰酶消化,离心后重悬细胞,流式细胞术检测其荧光强度。对照组作为参照(荧光强度为 ),其余组与之比较代表其相对 的活性。生化法检测上清液中氧化应激水平细胞按方法处理以后,收集经胰蛋白酶消化后的各组细胞,在冰上超声裂解,离心后取上清液。按照试剂盒步骤硫代巴比妥酸法检测,黄嘌呤氧化酶法检测 ,分光光度法检测 。检测上清液中的炎症因子细胞处理同方法,采用 试剂盒按说明书步骤检测上清液中 、和 水平。检测 、的表达水平取各组细胞,采用 法提取细胞内总,超微量分光光度计检测 浓度后置于 冰箱保存。逆转录合成 ,以其为模板,管家基因作为内参,然后进行实时荧光定量 扩增。反应体系:,正向引物及反向引物各,补足 至总体积。反应条件:预变性,变性,退火,延伸,循环 次。循环结束后以 法计算目的基因 相对表达水平。引物序列和产物长度见表。表 引物序列和产物长度基因引物序列产物长度()上游引物:下游引物:上游引物:下游引物:上游引物:下游引物:检测 通路相关蛋白表达水平取对数生长期的星形胶质细胞,按方法分组及处理,每组分别设立个复孔。培养结束,收集经胰蛋白酶消化后的各组细胞,超声细胞破碎仪冰上粉碎后离心,取上清液即获得细胞总蛋白,采用 法测定蛋白浓度,制备蛋白样品,根据蛋白浓度调整上样量。蛋白样品 沸水高温变性后,加至 十二烷 基 硫 酸 钠聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳()胶加样孔内,恒压浓缩胶电泳,、恒压分离胶电泳,恒定电流进行转膜,洗膜后室温下以脱脂奶粉中摇床上封闭,取膜加入 、一抗稀释液与内参 抗体稀释液(稀释度分别为 、),孵育过夜;次日以 溶液清洗次,每次 ,加入辣根过氧化物酶标 记 羊 抗 兔 ()二 抗(稀 释 度 为 ),室温下摇床孵育;以 洗膜次,每重庆医学 年月第 卷第期次 ,避光,采用 显色后凝胶成像系统曝光显影定影成像。采用 软件分析,以目的蛋白内参蛋白灰度值之间的比值表示相关蛋白的表达水平。统计学处理采用 软件进行数据分析,计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用 检验,以 为差异有统计学意义。结果细辛醚对 诱导的星形胶质细胞存活率和凋亡率的影响与对照组比较,模型组、组、细辛醚组及细辛醚 组细胞存活率明显下降,细胞凋亡率明显升高()。与模型组比较,细辛醚组及细辛醚 组细胞存活率明显升高,细胞凋亡率 明 显 下 降,组 则 相 反()。与 组比较,细辛醚组及细辛醚 组细胞存活 率明 显升高,细 胞凋亡 率明显 下降(),见表、图。细辛醚对 诱导的星形胶质细胞氧化应激水平的影响与对照组比较,模型组、组及细辛醚 组 漏出率、荧光强度明显升高,、水平明显下降()。与模型组比较,细辛醚组及细辛醚 组 漏出率、荧光强度明显下降,、水平明显升高,而 组上述指标则相反()。与 组比较,细辛醚组及细辛醚 组 漏出率、荧光强度明显下降,、水平明显升高(),见表。表各组脑组织星形胶质细胞存活率及凋亡率比较(,)组别细胞存活率细胞凋亡率对照组 模型组 组 细辛醚组 细辛醚 组 :,与对照组比较;:,与模型组比较;:,与 组比较。图各组星形胶质细胞 双染法细胞凋亡图表各组脑组织星形胶质细胞氧化应激水平比较(,)组别 漏出率()()()()荧光强度()对照组 模型组 组 细辛醚组 细辛醚 组 :,与对照组比较;:,与模型组比较;:,与 组比较。细辛醚对 诱导的星形胶质细胞炎症因子水平的影响与对照组比较,模型组、组、细辛醚组及细辛醚 组 、水平明显升高()。与模型组比较,细辛醚组及细辛醚 组 、水平明显下降(),而 组 上 述 指 标 则 相 反()。与 组比较,细辛醚组及细辛醚 组 、水平明显下降(),见表。细辛醚对 诱 导的星 形胶质细胞中 和 表达的影响与对照组比较,模型组、组及细辛醚 组 、表达明显下降()。与 模 型 组 比 较,细 辛 醚 组 及细 辛 醚 组 、表 达 明 显 升 高,而 组上述指标则相反()。与 组比较,细辛醚组及细辛醚 组的 、表达明显升高(),见表。细辛醚对 诱导的星形胶质细胞 重庆医学 年月第 卷第期通路相关蛋白表达的影响与对照组比较,模型组、组及细辛醚 组 、蛋白表达明显下降()。与模型组比较,组、细辛醚组及细辛醚 组 、蛋白表达明显升高,而 组上述指标则相反()。与 组比较,细辛醚组及细辛醚 组 、蛋白表达明显升高(),见表、图。表各组脑组织星形胶质细胞炎症因子水平比较(,)组别 对照组 模型组 组 细辛醚组 细辛醚 组 :,与对照组比较;:,与模型组比较;:,与 组比较。表各组脑组织星形胶质细胞 和 表达水平的检测结果(,)组别 对照组 模型组 组 细辛醚组 细辛醚 组 :,与对照组比较;:,与模型组比较;:,组比较。表各组脑组织星形胶质细胞相关蛋白表达水平(,)组别 对照组 模型组 组 细辛醚组 细辛醚 组 :,与对照组比较;:,与模型组比较;:,组比较。图各组星形胶质细胞 、蛋白表达的电泳图讨论近年来,缺血性脑卒中的发生率持续上升。缺血性脑卒中血流恢复会加重损伤并引起 。的发生与线粒体能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、离子平衡失衡、氧化应激、炎性反应、细胞凋亡和血脑屏障破坏等有关。因此,预防和治疗 是缺血性脑卒中治疗的重点。脑缺血再灌注引起脑损伤,这与脑内的氧自由基密切相关。脑缺血 再灌注诱导的 释放和 积累可以直接反映脑缺血的严重