2023年性别鉴定计.docx

性别鉴定计 篇一：性别鉴定 PCR性别鉴定实验 ： 人类y染色体上特异性重复序列（humany-chromosome specific repetitive DNA family sequence）是一种重复性很高的特异性序列，引物能在人类广阔的基因组中对它进行特异性识别，因此，它是良好的PCR材料。本实验通过对人黏膜细胞的DNA提取、基因组DNA制备、PCR扩增y染色体上特异性重复序列、PCR产物的电泳检测的方法实现人的性别鉴定。通过此次实验，我们得到了预期结果，只有极少数因实验操作等人为失误导致实验与预期不符的情况发生，总之，用PCR技术扩增y染色体上特异性重复序列的方法是可靠的。 关键词： 基因组DNAPCR y染色体上特异性重复序列电泳检测 引言 PCR（Polymerase Chain Reaction）又称聚合酶链式反响，它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能别离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。 鉴定性别方法有很多，巴氏小体观察法、染色体分型技术都可以对人的性别进行鉴定，但是染色体分型需要专门的技术和人才，巴氏小体鉴定人的性别准确率低，而且无法鉴别XXY、X0核型的性别。而PCR的方法操作简单，准确率高。由于Y染色体是区分性别的本质，PCR可以很简便地从基因组DNA中直接获得Y染色体DNA进行分析鉴定。本实验就是通过PCR技术扩增y染色体上特异性重复序列来实现性别鉴定。 人类及哺乳动物的性别决定和分化是一个复杂的过程，涉及和未知的多个基因。SRY基因是人类及许多哺乳动物中一段Y染色体特异的保守序列，人类SRY编码区全长615bp。该基因的突变将导致XY染色体女性化（特纳氏综合征）；而含有该基因的染色体片段如果易位到X染色体，那么导致XX男性综合征。但是由于人类的基因组太大，有700多MB,引物要从700多MB的序列中识别615bp的序列十分困难，因此，本实验选取的是一种更容易被引物识别的序列——y染色体上特异性重复序列（human y-chromosome specific repetitive DNA family sequence）来进行PCR扩增。 电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于别离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。 综上，本实验通过对人口腔黏膜细胞的DNA提取、基因组DNA制备、PCR扩增y染色体上特异性重复序列、PCR产物的电泳检测的方法实现人的性别鉴定，取得了良好的效果。 正文 1.材料和方法 1.1 材料和试剂 实验材料：人口腔黏膜细胞 实验试剂：ddH2O、10×Buffer、dNTP(2.5mM each)、PrimerF(10μM)、PrimerR(10μM)、Taq酶（5U/μL）、TAE、EB、agarose,etc. 实验仪器：离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、1.5mL Ep管、金属浴锅、制胶槽、制胶板、样品梳等 1.2实验方法 1.口腔上皮细胞DNA样品制备 （1）取一高压过的Ep管，做好标记； （2）取60μL细胞裂解液至一个Ep管中； （3）先用水漱口，然后用消毒牙签（钝头）刮取口腔上皮，弃去第一次刮取物，保存第二刮取物； （4）将消毒牙签（钝头）放于Ep管细胞裂解液中快速转动，释放细胞； （5）50℃水浴锅保温20min。 （6）在等待过程中建立PCR反响体系。即取一个干净的PCR管，在冰浴中，依序参加表1中的成分（除了模板以外其他都加好）。另外要设置阴性对照和阳性对照。阴性对照不加模板，阳性对照参加男性基因组DNA。 （7）95℃金属浴保温除模版外PCR反响体系10min。 （8）12,000rpm离心除模版外PCR反响体3min，获得DNA溶液。 （9（10）将样品放入PCR仪中，按照表2的PCR反响条件进行目的片段DNA扩增。 2.1.2%的琼脂糖凝胶电泳 （1）正确组装1套制胶槽、制胶板、样品梳（使用2排25齿的梳子）。 （2）取80mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.96g琼脂糖，倒入瓶中，轻旋混匀。轻 旋瓶盖，放入微波炉中加热沸腾3～4次，至溶液澄清无颗粒。 （3）待溶液冷却至60℃左右，参加40μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5μg/mL，轻旋混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固（冷却凝固时间要在30min以上）。 （4）在20μL PCR反响液中参加4μL上样缓冲液，用微量移液器吹吸混匀。 （5）将凝胶中的梳子轻轻拔出，将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至高出胶面约1mm。 （6）将上述混合好的DNA样品，按照表3的顺序，点样到凝胶中。 （7）开启电泳仪电源 。 （8）选择适宜的电压（100V）和时间（20min）。 （9）将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。 （10）启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。 （11）电泳结束，关闭电源，取出凝胶,紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。 2．结果 Y染色体特异性重复序列烦人DNA的PCR扩增电泳结果如图1所示。 图1-11.2%的琼脂糖凝胶电泳图（1组至6组） 图1-2 1.2%的琼脂糖凝胶电泳图（7组至10组） 图1-1的泳道1、泳道23、图1-2的泳道1、泳道16加的是DL2022 DNA marker，起指示DNA条带的作用。DL2022 DNA marker的条带大小由上至下分别是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp。由于点样时间太长，图1-1泳道1和图1-2的泳道1的DL2022 DNA marker样品弥散了，因此在图中没有显示出来。 图1-1的泳道2、13，图1-2的泳道5是参加的样品是阴性对照，阴性对照组PCR反响体系不加模版，在100bp处有引物多聚体的条带，对女生的电泳结果起对照作用。 图1-1的泳道12，图1-2的泳道15是参加的样品是阳性对照，在299bp处有条带，能对男生的电泳结果起对照作用。 除DL2022 DNA marker的上样孔外，其他上样孔在100bp处都有或深或浅的条带，此处的条带是引物自身配对所形成的引物多聚体，条带深可能是因为：①上样量相对较多；②所配总反映体系时没有充分混匀，导致分装过程中引物含量相对较多；③引物自身形成二聚体的量过多。条带浅可能是因为：①上样量相对较少；②所配总反映体系时没有充分混匀，导致分装过程中引物含量相对较少；③引物自身形成二聚体的量过少。 女生的上样孔为图1-1的泳道4、6、8、10、14、15、17、20、22和图1-2的泳道2、3、6、7、8、10、11、14。所有的上样孔在100bp附近都有条带，是由于形成了引物多聚体。图1-2的泳道6、7、8、10、11、14除了在100bp处有条带之外，在其上方也有较弱的条带，可能是操作过程中引入了DNA杂质而导致样品不纯。 男生的上样孔为图1-1的泳道3、5、7、9、11、16、18、19、21和图1-2的泳道4、9、12、13。除泳道16外，其他上样孔在250bp靠上的位置均存在299bp的条带，有的条带深有的条带浅，可能是由于在取样过程中用牙签刮取的口腔上皮细胞量不同，导致所提取的DNA量不同，PCR扩增的片段的量也就不同了，也有可能是上样过程中点样量存在差异而导致最终条带亮度不同。男生的泳道也均会形成100bp大小的引物多聚体。泳道16没有299bp的条带可能是因为DNA模版没有加进PCR反响体系。 我的上样孔为图1-2的泳道7，存在100bp左右的引物多聚体，我的条带较浅是因为点样过程中样品点漂了；由于我的条带较浅，我的杂质也不太明显。 3.讨论 1.在建立PCR反响体系的时候，每桌可配成master后分装，这样可以保证加样量比较均一和准确，此外，每桌设置一个阴性对照和一个阳性对照。 2.女生注意保护好样品，以免样品被污染使电泳结果不准确。 3.PCR的反响条件有三个值需要人为设定，分别是复性温度（X℃）、延伸时间（Y s）、和循环次数（Z Cycles）。复性温度（X℃）由片段复杂程度决定的，片段复杂程度越高，复性温度越高。延伸时间（Y s）取决于目的基因的长度，目的基因越长，延伸时间越长。对于循环次数（Z Cycles），循环次数越多DNA浓度越高，循环次数越少DNA浓度越低。 4.本实验PCR的人类Y染色体特异重复序列的最终产物大小是299bp，而前引物序列为 ttccaatccattcctttcctttcgcttgc，序列长度是28bp，Tm值是54.96℃；而后引物序列为 ggatagtaatggactggagtgaaatggac，序列长度是29bp，Tm值是55.05℃。因此，我们扩增的片段实际大小为242bp(299-29-28=242)。 5.引物设计时应防止一下几个方面：①防止引物多聚体的形成：尽可能防止两引物的3’端有较多碱基互补，引物二级结构的存在可能影响其与模版的特异结合和有效结合；②防止发夹结构的形成：防止引物3’端形成发夹结构；③引物3’端的选择：引物3’端需与模板DNA严格配对，不能有任何修饰，3’端的错配那么会影响DNA聚合酶的有效起始；最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对；最后1～2个碱基（nt）最好不要用T/A，因为T/A之间只有两个氢键，引物与模版结合不牢固。④防止引物在模版内部的错配：引物在模板内应具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低，目的产物带将减少。可以在引物设计好后，最好做blast检测，检查同一物种基因组中是否存在高度同源序列。 6.引物5’端可引入与模板DNA不配对的碱基，如：①限制性核酸内切酶识别序列，以方便克隆操作；②各种寡核苷酸接头；③可改变某个碱基，从而在产物中引入点突变；④可利用放射性或非放射性物质（如生物素、地高辛等）进行标记，以方便后续分析、检测。 7.引物设计时应该把握以下几点：①引物长度一般为15-30nt：某些长的PCR片段和特殊的PCR片段需要更长的引物，引物越长，与模版结合的特异性也就越好，但是引物过长，包含的碱基越多，发生错配的概率就越高，通常更易于形成包括发卡结构、二聚体自身互补等二级结构。，此外，引物过长会导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶进行反响。如果引物太长就缩短退火时间，提高退火温度，杜绝形成引物二聚体；②引物GC含量在40%~60%之间：GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反响。上下游引物的GC含量不能相差太大，因为引物的Tm值与GC含量密切相关，GC含量相差太大不好设置退火温度；③Tm值最好接近72℃：Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度.有效启动温度,一般低于Tm值5℃.假设按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,那么有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最正确；④碱基要随机分布：同一碱基不应连续超过4个，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区 篇二：胎儿性别鉴定 胎儿性别鉴定 与性别相关的遗传疾病， 一些可能只出现在男性胎儿中，而还有一些可能只出现