LC-MS_MS测定人血浆中的对乙酰氨基酚浓度_肖江.pdf

收稿日期：2022-04-13基金项目：湖南省自然科学基金科药联合基金（编号：2020JJ9004）作者简介：肖江，硕士，高级工程师，E-mail:*通讯作者：帅海涛，硕士，中级工程师，E-mail:LC-MS/MS测定人血浆中的对乙酰氨基酚浓度肖 江1，帅海涛1*，唐璐强1，黄致远1，帅放文2（1.湖南省药用辅料工程技术研究中心有限公司，湖南 长沙，410331；2.国家药用辅料工程技术研究中心，湖南 长沙410331）摘 要：目的 建立一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定人血浆中对乙酰氨基酚含量的方法。方法 待测血浆样品经乙腈沉淀后，LC-MS/MS法检测，以对乙酰氨基酚-d3为内标。色谱柱为XBridge-C18（4.6 mm100 mm，3.5 m），流动相为0.1%甲酸水溶液与乙腈，采用等度洗脱方式，流速为0.4 ml/min，进样量为5 l，柱温为25；质谱采用电喷雾离子化方式，以正离子多反应监测模式进行定量分析。结果 本方法线性范围为0.18 g/ml，最低定量限为0.1 g/ml，最低定量限、低、中、高浓度对应的精密度分别为9.7%，2.0%，0.7%，0.7%，准确度分别为92.7%，90.8%，97.2%，100.6%，低、高浓度的冻融稳定性相对偏差为9.3%，0.7%。结论 本方法方便快速、灵敏度高、专属性强、结果可靠，可用于对乙酰氨基酚制剂的药动学及生物等效性研究。关键词：对乙酰氨基酚；液质联用法；血浆；药动学中图分类号：R969.1 O657.63 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）01-0081-04DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.01.016Determination of Paracetamol in Human Plasma by LC-MS/MS XIAO Jiang1,SHUAI Hai-tao1,TANG Lu-qiang1,HUANG Zhi-yuan1,SHUAI Fang-wen2（1.Hunan Pharmaceutical Excipients Engineering and Technology Research Center Ltd.,Changsha 410331,China;2.National Engineering and Technology Research Center of Pharmaceutical Excipients,Changsha 410331,China）Abstract：Objective To establish a method for the determination of paracetamol in human plasma by liquid chromatography-mass/mass spectrometry(LC-MS/MS).Methods The plasma samples were precipitated by acetonitrile.LC-MS/MS was adopted with paracetamol-d3 as internal standard.The chromatographic column was XBridge-C18(4.6 mm100 mm,3.5 m),the flow phase was 0.1%formic acid solution and acetonitrile,the injection volume was 5 l,the column temperature was 25 ,and the flow rate was 0.4 ml/min,and isocratic elution was performed.Multi-stage ESI-MS was adopted under the positive ion detection modes.Results The standard curve was linear in the range of 0.1-8 g/ml and the lower limit of quantification was 0.1 g/ml for Paracetamol.The precision of the lower limit of quantification,low,medium and high concentration were 9.7%,2.0%,0.7%and 0.7%.The accuracy of the lower limit of quantification,low,medium and high concentration was 92.7%,90.8%,97.2%and 100.6%.The relative deviation of freeze and thaw stability of low and high concentration was 9.3%and 0.7%.Conclusion The method can be rapid,accurate,sensitive and reliable,and can be applied to pharmacokinetic and bioequivalence study of paracetamol formulation.Key Words:paracetamol;LC-MS/MS;plasma;pharmacokinetics食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 81对乙酰氨基酚，又名扑热息痛，化学名N-（4-羟基苯基）乙酰胺，是最常用的解热镇痛药之一1，是许多感冒药和止痛药的主要成分，临床应用极为广泛，易造成过量使用和滥用情况，引起药物性肝功能损伤2-7。国外已将对乙酰氨基酚血药浓度作为急诊中毒患者常规检测项目5，因此有必要建立快速准确的血药浓度检测方法，进行对乙酰氨基酚制剂的血药浓度药动学研究，并指导临床用药。目前，对乙酰氨基酚的血药浓度检测方法有紫外检测法（UV）、高效液相-紫外检测法（HPLC-UV）、液相色谱-质谱法（LC-MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等。其中，HPLC法是较常用的浓度检测方法8-13，但分析时间长、专属性不强、灵敏度不高。故本文开发以同位素标记物为内标的LC-MS/MS方法检测人血浆中对乙酰氨基酚的浓度，与HPLC及其他LC-MS/MS14-17方法相比，具有干扰小，灵敏度高，定量限低，血浆用量少，分析时间短等特点。1 仪器与试剂Agilent 1290II型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AB Sciex Triple Quad 4500型质谱仪（美国Sciex公司）；XPE26型电子天平（百万分之一），XS205DU型电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多）；MIX-30S型迷你混合仪（杭州米欧）；TDL16型冷冻离心机（2 ml，长沙英泰）；氮气发生器（上海登晨）；Milli-Q Direct 8型超纯水机（德国默克密理博）。空白血浆（含肝素钠，中南大学）；对乙酰氨基酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100018-201610）；对乙酰氨基酚-d3对照品（坛墨质检科技，批号：1752007）；乙腈（德国默克）。2 方法与结果2.1 溶液配制2.1.1 标准曲线溶液配制 精密称取对乙酰氨基酚对照品10 mg，置入10 ml量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得含对乙酰氨基酚浓度为1 mg/ml的对照品储备溶液，用乙腈将储备液稀释成质量浓度为0.1，0.2，0.5，1，2.5，5，6，8 g/ml的标准系列溶液。2.1.2 内标溶液配制 精密称取同位素标记对乙酰氨基酚-d3对照品10 mg，加乙腈溶解后定容至10 ml量瓶，摇匀，即得含对乙酰氨基酚-d3浓度为1 mg/ml的对照品储备溶液。吸取150 l内标对照品储备液置入10 ml棕色量瓶，用乙腈定容至刻度线，摇匀，即得浓度为15 g/ml的内标溶液。2.1.3 质控溶液配制 精密称取对乙酰氨基酚对照品10 mg，置入10 ml量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得含对乙酰氨基酚浓度为1 mg/ml的对照品储备溶液，用空白血浆将储备液稀释成质量浓度为105，168，1260，7000 ng/ml的质控溶液。2.2 仪器条件2.2.1 液相条件 色谱柱：XBridge-C18（4.6 mm100 mm，3.5 m）；流量：0.4 ml/min；进样量：5 l；柱温：25；流动相：0.1%甲酸水溶液:乙腈=25:75。2.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正离子MRM模式检测，气帘气压力：40 psi；离子化电压5500 V；温度550。表1 质谱条件名称内标Q1/DaQ3/Da时间/ms去簇电压/V入口电压/V电离电压/V碰撞室出口电压/V对乙酰氨基酚-d3是155.1111.010088.010.0 22.0V14.0 对乙酰氨基酚否152.1110.010088.010.022.0V14.0V2.3 样品处理取血浆样本，涡旋3 min，移取血浆样本50 l置入2 ml离心管，加20 l内标工作液，涡旋1 min，加入乙腈400 l，涡旋5 min，离心10 min（6130 g），吸取上清200 l置入进样瓶（加内衬管），进样5 l，用内标法进行定量分析。2.4 液质联用方法的特异性离子扫描质谱分析使用MRM模式测定目标离子，含药血浆经LC-MS/MS分析测定得色谱图（见图1），色谱峰有较好的峰型对称性，基线平稳。2.5 基质效应 取6个不同批次的空白血浆各200 l置入2 ml82 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期离心管，分别加入400 l甲醇，涡旋5 min，离心10 min，取上清300 l，加入5 l阿莫西林溶液和10 l内标溶液，混匀后进样分析；另取200 l乙腈替代空白血浆同法操作。低、高浓度（168，7000 ng/ml）的基质效应比值率分别为0.99和0.96，表明对乙酰氨基酚及其同位素内标无血浆基质效应。结果见表2。表2 对乙酰氨基酚的血浆基质效应浓度水平 内标归一化基质效应因子 变异系数（CV）/%低浓度0.991.8 高浓度0.960.8 2.6 生物样本冻融稳定性为考察样本冻融对实验的影响，分别将低、高（168，7000 ng/ml）两个浓度的质控溶液经2次冻融循环后进行检测。质控溶液储存于-70 条件下，经过至少20 h（第一次冻存期）后，取出后放置在室温条件下融化。充分融化后的样本放回冰箱冷冻储存至少20 h，再进行下一次冻融循环。随新鲜配制的标准曲线样本一同测定，每个浓度平行测定6份。计算得低、高浓度的冻融稳定性RSD分别为9.3%，0.7%，表明冻融条件对样本的检测无影响。结果见表3。表3 对乙酰氨基酚冻融稳定性试验数据冻融次数浓度水平平均值/ngml-1准确度/%CV/%2次低浓度163.597.39.3 高浓度7743.3110.60.7 2.7 线性关系和定量下限标准曲线中对乙酰氨基酚的浓度分别为0.1，0.2，0.5，1，2.5，5，6，8 g/ml，计算对乙酰氨基酚峰面积和内标峰面积的比值，以峰面积比值对血药浓度做权重回归计算，求得对乙酰氨基酚的线性方程为y=0.000 056 2x+0.001 78（r=0.9994）。结果表明，对乙酰氨基酚在0.18 g/ml质量浓度范围内线性关系良好。0.1 g/ml浓度水平标准血浆样本色谱图中待测物与内标色谱峰的信噪比均不小于5，故该方法定量下限定为0.1 g/ml。2.8 精密度与准确度取4个不同浓度的质控溶液，浓度为LLOQ（105 ng/ml），LOQ（168 ng/ml），MOQ（1260 ng/ml），HOQ（7000 ng/ml）浓度，按2.3项处理方法进行样品处