RBM8A基因对子宫内膜癌...、迁移和凋亡的作用及其机制_谭冬梅.pdf

肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 CancerResPrevTreat,2023,Vol.50,No.127doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2023.22.0705RBM8A基因对子宫内膜癌HEC-1A细胞 增殖、迁移和凋亡的作用及其机制谭冬梅1，张静静2，师一民1，韩赛2，耿炜1，孙建一1，王雅玉1，张秀荣1Effect and Mechanism of RBM8A on Proliferation,Migration and Apoptosis of Human Endometrial Cancer HEC-1A CellsTANDongmei1,ZHANGJingjing2,SHIYimin1,HANSai2,GENGWei1,SUNJianyi1,WANGYayu1,ZHANGXiurong11.TCM Gynecology,Shandong Provincial Maternal and Child Health Care Hospital,Jinan 250000,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250000,ChinaCorresponding Author:ZHANG Xiurong,E-mail:Abstract:Objective ToinvestigatetheeffectofsilencedRBM8Ageneonthebiologicalbehavior(proliferation,migration,andapoptosis)ofhumanendometrialcancerHEC-1Acellsanditspossiblemechanism.Methods ThehairpinshRNAtargetedbytheRBM8Agenewasdesigned,andthebestshRNAsilencingfragmentwasscreened.TherecombinantlentiviralinterferencevectorcarryingthetargetgenewasconstructedandusedtoinfectHEC-1Acells.CellswithstableknockdownofRBM8Agenewerescreenedbypuromycinastheexperimentalgroup(shRBM8A),whiletheshRNAofnonsensesequencewasdesignedasthecontrolgroup(shControl).CCK-8methodwasusedtodetectcellproliferation,andflowcytometrywasusedtodetectcellapoptosis.Transwellassaywasusedtodetectcellmigrationandinvasion.Westernblotwasusedtoanalyzetheexpressionofapoptosis-relatedproteinsandEMTsignaltransductionpathwayrelatedproteins.Results IncomparisonwiththeshControlgroup,afterRBM8Aknockdown,HEC-1Acellproliferationwasreduced,apoptosiswasincreased,migrationandinvasionabilityweresignificantlyinhibited(P0.05),theexpressionofapoptosis-relatedproteinscleavedcaspase9andcaspase3increased,EMT-relatedproteinE-cadherinexpressionincreased,andVimentinexpressiondecreased.Conclusion RBM8Agenesilencingcaninhibittheproliferation,migration,andinvasionandpromotetheapoptosisofendometrialcancercells.TheinhibitionofEMTsignaltransductionpathwaymaybeitsmechanism.Key words:Humanendometrialcancer;RBM8A;Proliferation;Migration;Apoptosis;Epithelial-mesenchymaltransitionFunding:TraditionalChineseMedicineScienceandTechnologyProjectofShandongProvince(No.2021M202)Competing interests:Theauthorsdeclarethattheyhavenocompetinginterests.摘 要：目的 探讨沉默RBM8A基因表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞生物学行为的影响及其可能机制。方法 设计RBM8A基因靶向的发夹状shRNA，筛选出最佳shRNA沉默片段，构建携带有目的基因的重组慢病毒干扰载体并感染HEC-1A细胞，通过嘌呤霉素筛选出稳定敲低RBM8A基因的细胞作为实验组（shRBM8A），同时设计无意义序列的shRNA作为对照组（shControl）。CCK-8法检测细胞增殖能力，Transwell检测细胞迁移和侵袭能力，流式细胞计数法检测细胞凋亡，Westernblot法分析凋亡相关蛋白、上皮间质转化（EMT）信号转导通路相关蛋白的表达。结果 与shControl组比较，敲低RBM8A后HEC-1A细胞增殖减慢，凋亡率增加，且迁移与侵袭能力受到明显抑制（P0.05），凋亡相关蛋白cleaved-caspase9和cleaved-caspase3表达增加，EMT相关蛋白E-cadherin表达升高，Vimentin表收稿日期：2022-06-22；修回日期：2022-10-31基金项目：山东省中医药科技项目（2021M202）作者单位：1.250000济南，山东省妇幼保健院中医妇科；2.250000济南，山东大学齐鲁医院妇产科通信作者：张秀荣（1966-），女，硕士，主任医师，主要从事妇产保健及妇科肿瘤的研究，E-mail:作者简介：谭冬梅（1981-），女，博士，主治医师，主要从事妇产保健及妇科肿瘤的研究基础研究达降低。结论 沉默RBM8A基因可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡，抑制EMT信号转导通路可能是其作用机制。关键词：子宫内膜癌；RBM8A；增殖；迁移；凋亡；上皮间质转化中图分类号：R737.33开放科学(资源服务)标识码(OSID)：肿瘤防治研究2023年第50卷第1期 CancerResPrevTreat,2023,Vol.50,No.1280 引言子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的25%左右，近20年全球范围内的发病率逐年上升且呈现年轻化趋势。据中国癌症流行病学统计显示，我国子宫内膜癌每年新发病率为634/105，死亡率为21.8/1051。子宫内膜癌目前以手术治疗为主，但中晚期及复发患者常常因转移等失去手术机会，且化、放疗效果不理想，使其5年生存率仅维持在20%57%2-5。因此，子宫内膜癌的早期发现及治疗至关重要，寻找子宫内膜癌生物学功能相关基因，用于早期诊断和治疗内膜癌的有效分子治疗靶点已经成为亟待解决的科学问题。RNA结合基序蛋白8A（RBM8A）是外显子连接复合体（EJC）的核心因子。EJC在真核生物中充当转录后调控网络中的节点6-7。RB-M8A基因位于染色体1q21.1，在细胞中大量表达，在细胞质和细胞核之间穿梭8-9。有文献报道，RB-M8A促进脑恶性胶质瘤的生长及迁移10-11，且在肝癌中高表达并促进肿瘤进展12-13。但其在子宫内膜癌发生发展中的作用机制仍不明确。本研究拟探讨RBM8A对子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响，探索RBM8A在子宫内膜癌中发挥作用的通路，从而明确其在子宫内膜癌发生发展中的作用，为开发子宫内膜癌新的治疗靶点提供理论基础。1 材料与方法1.1 细胞系和细胞培养人子宫内膜HEC-1A细胞株购自中国科学院细胞库（中国上海），在RPMI1640（HycloneLabo-ratories,Logan,UT,美国）培养基中培养。培养基中添加10%胎牛血清（澳大利亚悉尼Gibco公司）和1%青霉素-链霉素，并在37、5%CO2二氧化碳培养箱中孵育。1.2 抗体与试剂RBM8A抗体购自美国Proteintech公司，E-cad-herin抗体、Vimentin抗体、cleaved-caspase9、cleaved-caspase3抗体及GAPDH内参均购自美国CST有限公司。RBM8A敲低质粒及空载质粒构建由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。反转录试剂盒及2SYBRGreenqPCRMix试剂盒均购自上海翊圣生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。1Bradford蛋白定量试剂盒购自美国Bio-Rad公司。Tran-swell小室购自美国Corning公司。RBM8A引物及GAPDH内参引物由北京擎科生物科技有限公司合成。RBM8A引物：正义：5-GATGGGGAC-GAGAGCATTCAC-3，反义：5-CGCTGTCATA-ATCCTCACGCA-3；GAPDH内参引物：正义：5-CTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3，反义：5-CTTGCCCACAGCCTTGGCAG-3。1.3 方法1.3.1 实时定量PCR法检测RBM8AmRNA表达水平 取对数生长期HEC-1A细胞，胰酶消化，离心收集细胞，TRIzol法提取总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，RT-qPCR法检测细胞中RBM8AmRNA水平。以GAPDH为内参，计算RBM8A相对表达量，绘制溶解曲线，最终数据以2-Ct方法进行分析。实验重复3次。1.3.2 慢病毒感染 将对数生长期HEC-1A细胞按3105个/孔接种于6孔板，培养24h待细胞贴壁，融合至50%左右时，根据预实验结果，加入等量病毒上清液（其中无意义序列shControl为对照组，shRBM8A为实验组）感染细胞6h后换液，48h后荧光显微镜观察感染效率，待感染效率达80%时，用嘌呤霉素筛选感染成功的HEC-1A细胞并获得稳转细胞株用于后续实验。RT-qPCR及Westernblot法鉴定慢病毒过表达效果。1.3.3 细胞增殖实验 CCK-8法检测细胞增殖。取实验组及对照组处对数生长期的HEC-1A细胞，胰酶消化计数，使细胞密度为2104个/毫升，按每孔200 l接种于96孔板，每组均设置5个复孔，于37、5%CO2培养箱中培养。分别在培养1、2、3、4、5d时每孔加20 l CCK-8检测试剂继续培养45min，酶标仪检测各孔在波长450nm处的OD值，并绘制细胞生长曲线，OD值越大表示活细胞数越多，细胞增殖越快。实验重复3次。1.3.4 Transwell实验 取Transwell小室置于24孔板，将shControl、shRBM8A组HEC-1A细胞，胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，离心后弃上清液，用无血清的培养基重悬，使其细胞密度为5105个/毫升。迁移试验：取上述重悬细胞，上室加入200 l细胞悬液，下室加入700 l含10%胎牛血清的培养基。培养48h后，取出小室，PBS清洗3次，棉签轻轻擦拭上室细胞，4%多聚甲醛固定15min，0.4%结晶紫染色5min，PBS清洗干净并晾干，