TOR抑制剂雷帕霉素对荔枝霜疫霉生长发育及自噬的影响_吕林.pdf

吕林，杨成东，张雪，等.TOR 抑制剂雷帕霉素对荔枝霜疫霉生长发育及自噬的影响J.福建农业学报，2022，37（11）：14481453.LVL,YANGCD,ZHANGX,etal.EffectofTORInhibitorRapamycinonGrowth,Development,andAutophagyofPeronophythora litchiiJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：14481453.TOR 抑制剂雷帕霉素对荔枝霜疫霉生长发育及自噬的影响吕林1,2，杨成东1,2，张雪1，于戈1，陈泰旭1，陈庆河1,2*（1.海南大学植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海南海口570228；2.海南大学三亚南繁研究院/崖州湾种子实验室，海南三亚572025）摘要：【目的】明确 TOR（TargetofRapamycin）信号通路抑制剂雷帕霉素对荔枝霜疫霉生长发育、致病性及自噬的影响。【方法】采用不同浓度的 TOR 抑制剂雷帕霉素处理荔枝霜疫霉菌，观察不同浓度雷帕霉素对荔枝霜疫霉的菌丝生长及形态、孢子囊产生数量、游动孢子释放和致病性的影响，并通过丹酰戊二胺（MDC）染色观察细胞自噬。【结果】雷帕霉素处理后，荔枝霜疫霉的菌丝生长明显受到抑制，半最大效应浓度（EC50）值为 29.18ngmL1，随着雷帕霉素浓度的增加，菌丝生长抑制不同程度增加；当雷帕霉素深度为 25.0ngmL1时，菌落生长抑菌率为45.3%，孢子囊产生数量为 8.0104个mL1，仅为对照组的 27.9%；雷帕霉素处理能促进游动孢子的释放；同时严重影响荔枝霜疫霉菌的致病性。通过自噬体观察表明，雷帕霉素处理后荔枝霜疫霉菌丝中自噬体的数量显著增加，促进荔枝霜疫霉的细胞自噬。【结论】TOR 抑制剂雷帕霉素通过调控荔枝霜疫霉的细胞自噬，从而影响病菌的生长发育及致病性，研究结果为荔枝霜疫霉的致病机制提供科学依据。关键词：荔枝霜疫霉；雷帕霉素；TOR 抑制剂；生长发育；细胞自噬中图分类号：S436文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11144806Effect of TOR Inhibitor Rapamycin on Growth,Development,and Autophagy ofPeronophythora litchiiLVLin1,2,YANGChengdong1,2,ZHANGXue1,YUGe1,CHENTaixu1,CHENQinghe1,2*（1.Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests,Ministry of Education/College of PlantProtection,Hainan University,Haikou,Hainan570228,China;2.Sanya Nanfan Research Institute,Hainan University/HainanYazhou Bay Seed Laboratory,Sanya,Hainan572025,China）Abstract:【Objective】Effects of the target of rapamycin(TOR)inhibitor rapamycin on the growth,development,pathogenicity,andautophagyofPeronophythora litchiwerestudied.【Method】Themycelialgrowth,sporangialproduction,zoospore release,and pathogenicity of the P.litchi after being treated by the TOR inhibitor rapanmycin in varyingconcentrations were determined,while the mycelial autophagy observed under a microscope with MDC staining.【Result】RapamycinexhibitedsignificantinhibitoryeffectonthemycelialgrowthofP.litchiiwithanEC50valueof29.18ngmL1andvaryingextentsofincreaseswithhigherdosages.Whentreatedwith25.0ngmL1rapamycin,theinhibitionratewas45.3%andthesporulationat8.0104sporangiamL1(whichwas27.9%ofcontrol),whilethezoosporereleaseincreased,but the virulence of P.litchii significantly reduced.The MDC-stained autophagosomes significantly increased as well.【Conclusion】The TOR signaling pathway inhibitor rapamycin played an important role in the mycelial growth,development,andvirulenceofP.litchii.Key words:Peronophythora litchii；rapamycin；TORinhibitor；growthanddevelopment；autophagy收稿日期：20220825初稿；20220912修改稿作者简介：吕林（1998），男，硕士研究生，主要从事疫霉菌基因功能研究（E-mail：）*通信作者：陈庆河（1971），男，博士，研究员，主要从事作物卵菌病害研究（E-mail：）基金项目：国家自然科学基金项目（32160614）；海南省自然科学基金创新团队项目（321CXTD437）；福建省作物有害生物监测与治理重点实验室开放基金（MIMCP-202102）；海南大学科研启动基金项目KYQD(ZR)-20080福建农业学报2022，37（11）：14481453http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.0100引言【研究意义】荔枝属于亚热带水果，主要分布于我国的南部和东南部，深受人们喜爱，而由荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）侵染引起的荔枝霜疫病严重影响荔枝的生长发育，是影响我国荔枝产量最为严重的病害12。荔枝霜疫霉主要为害荔枝的果实，也会影响花穗和叶片，为害严重时，损失率可达 30%60%34，深入系统解析荔枝霜疫霉的致病机制对荔枝霜疫病的绿色防控具有重要意义。【前人研究进展】细胞自噬是一种细胞内蛋白质降解过程，在真核生物中是保守的，在细胞自我保护和生存等过程中发挥重要作用5，其过程是细胞内蛋白质通过称为自噬体的膜结构转运到溶酶体和液泡，并被降解，从而清除细胞内受损的蛋白质、细胞器或入侵的病原体6。雷帕霉素是一种自噬诱导剂，其所作用的 TOR 信号通路在多种真核生物生长发育过程中发挥着重要作用7。雷帕霉素的靶标(TOR)是一种保守的Ser/Thr激酶，可根据环境因素调节真核细胞的生长和代谢，细胞自噬由雷帕霉素靶蛋白复合物1(TORC1/mTORC1)调节89。前人的研究表明，在自噬途径中 Atg1 蛋白是 TOR 信号通路下游的第一个信号组成成分，而 Atg1 及其复合体在诱导细胞自噬发生中起到了重要作用10；在酿酒酵母中，雷帕霉素与 FK506 结合蛋白 FKBP12 形成复合体，然后该复合体与 TOR 激酶结合并抑制 TOR 信号通路11；在尖孢镰刀菌中 FoTOR1 相互作用蛋白 FoTIP4 作为 FoTOR信号传导的新成分，可调节尖孢镰刀菌的菌丝生长和致病性12。【本研究切入点】由于荔枝霜疫霉属于卵菌，其在进化上与真菌相差甚远,其大多数生化途径、侵染机制、结构特征都和植物病原真菌有显著差别13，TOR 信号通路在影响荔枝霜疫霉菌丝生长、产孢量、游动孢子释放和致病力方面的作用尚不明确。【拟解决的关键问题】利用 TOR 抑制剂雷帕霉素处理荔枝霜疫霉，通过分析其对病菌菌丝生长、孢子囊数量、游动孢子释放及致病性的影响，初步分析 TOR 信号通路对荔枝霜疫霉生长发育和自噬的影响，以期明确细胞自噬在致病中的作用机制。1材料和方法1.1试验材料供试菌株：荔枝霜疫霉（SHS3 菌株）由海南大学植物保护学院卵菌分子实验室保存。供试培养基：10%V8 培养基。配置方法：取100mLV8 汁过滤后，加入 900mLd.d.H2O，调节pH 值为 7.2，在 121 高压灭菌 20min。供试试剂：98%雷帕霉素(Rapamycin)购自北京索 莱 宝 科 技 有 限 公 司；二 甲 基 亚 砜（99.5%）（Dimethylsulfoxide,DMSO）购自西陇科学有限公司；丹酰戊二胺（99%）（Monodansylcadaverine，MDC）购自 Sigma-Aldrich 公司。1.2试验方法1.2.1雷帕霉素母液的配制取 25.0mg 雷帕霉素粉末加入 1.0mL 二甲基亚砜，充分溶解后得到 25.0mgmL1母液。使用前用二甲基亚砜稀释至需要使用的浓度。1.2.2雷帕霉素对荔枝霜疫霉菌落生长及形态的影响将荔枝霜疫霉菌在 V8 培养基上培养 5d 后，用打孔器(直径为 5mm)打取菌饼，接种到含有雷帕霉素终浓度为0、12.5、25、50、100ngmL1的 V8 培养基平板上，每次试验均设置 DMSO 对照组，设置3 个平行处理。培养 5d 后，利用十字交叉法测量雷帕霉素处理后的菌落直径，并计算其抑制率，每个试验重复 3 次。1.2.3雷帕霉素对荔枝霜疫霉孢子囊产生的影响将上述荔枝霜疫霉菌饼(直径为 5mm)接种到含有雷帕霉素终浓度 25.0ngmL1的 V8 培养基平板上，并设置 DMSO 和空白对照组，设置 3 个平行处理。培养 5d 后，向菌落中加入等量的去离子水，用毛刷刷洗菌丝 2 次，经过滤获得总孢子囊悬浮液。取 10L孢子囊悬浮液滴于血球计数板上，置于显微镜下观察，用血球计数板计数孢子囊的数量14。每个样品计数 6 次，设置 3 个平行处理，试验重复 3 次。1.2.4雷帕霉素对荔枝霜疫霉游动孢子释放的影响用1.2.3 的方法处理荔枝霜疫霉菌并获得孢子囊，将孢子囊放入 12 培养箱分别冷处理 20min 和 40min，均吸取 10L 滴于载玻片上，在显微镜下拍照并计数已释放的孢子囊个数和未释放孢子囊的个数，计算游动孢子的释放率，试验重复 3 次。1.2.5雷帕霉素对荔枝霜疫霉致病性的影响将活化后的荔枝霜疫霉菌接种到雷帕霉素终浓度 25.0ngmL1的 V8 培养基平板上，并设置对照组，培养5d 后用打孔器(直径 5mm)取菌丝边缘菌丝块备用。在托盘底部垫上三层吸水纸用去离子水浸润保湿。取大小叶龄相似的新鲜荔枝叶片及大小成熟度相似的新鲜荔枝果实，将 5mm 菌丝块接种到荔枝叶片及果实上，菌丝面朝下，以琼脂块为空白对照。密封托盘，置于 25 条件下保湿培养 3d，拍照并使用 ImageJ 软件15（http:/imagej.nih.gov/ij/）计算病斑面积。每次试验3 个果实或叶片为1 组，设置3 次重复。1.2.6MDC 染色自噬观察将活化后的荔枝霜疫霉第11期吕林等：TOR 抑制剂雷帕霉素对荔枝霜疫霉生长发育及自噬的影响1449菌接种于 V8 培养液中，25 黑暗培养