SKAP1通过调控ICAM...长、转移及免疫调节机制研究_郑再宏.pdf

第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023160DOI:10.13463/ki.cczyy.2023.02.011SKAP1 通过调控 ICAM-1 对宫颈癌模型小鼠肿瘤生长、转移及免疫调节机制研究郑再宏，闫锡钊，李 博，丁珍珍（沧州市人民医院妇产科，河北 沧州 061000）摘要：目的 探讨 SKAP1 通过调控细胞间黏附分子-1（ICAM-1）对宫颈癌模型小鼠肿瘤生长、转移及免疫调节的机制。方法 培养人宫颈癌细胞 HeLa，构建 SKAP1-miRNA 慢病毒干扰质粒和阴性对照 Neg-miRNA 空白慢病毒干扰质粒，分别感染 HeLa 细胞，随机分为对照组（细胞未做处理）、空质粒组（Neg-miRNA 组）和 SKAP1 基因沉默组（SKAP1-miRNA 组），每组 10 只。将稳定表达的 3 组细胞配制成单细胞悬液分别接种于对应组 BALB/c 裸鼠右前腋窝中部外侧皮下，记录各组肿瘤生长情况，30 d 后采用活体荧光成像技术检测肿瘤转移情况。处死裸鼠，取肿瘤组织，采用 Real-Time PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织SKAP1、ICAM-1 mRNA相对表达量，免疫组化法检测SKAP1、ICAM-1蛋白表达情况，Western blot 法检测 SKAP1、ICAM 蛋白相对表达量，流式细胞术检测免疫细胞 CD3+、CD4+、CD8+水平，ELISA 法检测 Th1 和 Th2 细胞因子水平。结果 细胞接种后饲养期间内，对照组和空质粒组裸鼠各死亡 1 只，SKAP1 基因沉默组死亡 2 只。各组瘤体体积均随时间延长而增大（P 0.05）；与对照组、空质粒组比较，SKAP1 基因沉默组各时间段瘤体体积减小、肿瘤细胞转移面积减小、荧光信号强度降低、肿瘤组织 SKAP1 和 ICAM-1 mRNA 及其蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（P 0.05）；与对照组、空质粒组比较，SKAP1 基因沉默组肿瘤组织免疫细胞 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及 Th1 细胞因子 IL-2、IFN-水平均升高，CD8+及 Th2 细胞因子 IL-4、IL-10 水平均降低（P 0.05）。结论 沉默 SKAP1 基因可以抑制 HeLa 细胞宫颈癌裸鼠移植瘤的生长及转移，逆转小鼠 Th1 向 Th2 漂移，恢复 Th1 表达优势，这一作用可能是通过下调 ICAM-1 表达实现的。关键词：宫颈癌；细胞间黏附分子-1；转移；免疫细胞中图分类号：R737 文献标志码：A 文章编号：2095-6258(2023)02-0160-06Study on the mechanism of SKAP1 on tumor growth,metastasis and immune regulation in cervical cancer model mice by regulating ICAM-1ZHENG Zaihong,YAN Xizhao,LI Bo,DING Zhenzhen(Department of Obstetrics and Gynecology,Cangzhou Peoples Hospital,Cangzhou 061000,China)Abstract:Objective To investigate the mechanism of SKAP1 on the tumor growth,metastasis and immune regulation in cervical cancer model mice by regulating the intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1).Methods The human cervical cancer cells HeLa were cultured,and the SKAP1-miRNA lentiviral interference plasmid and negative control Neg-miRNA blank lentiviral interference plasmid were constructed and infected with HeLa cells respectively.They were randomly divided into a control group(untreated cells),an empty plasmid group(Neg-miRNA group)and a SKAP1 gene silencing group(SKAP1-miRNA group),with 10 mice in each group.The three groups of stably expressed cells were prepared into a single cell suspension and inoculated subcutaneously in the middle and lateral sides of the right anterior axilla of the BALB/c nude mice in the corresponding groups,基金项目：河北省 2022 年度医学科学研究课题计划（20220315）作者简介：郑再宏（1984），女，硕士，主治医师，主要从事妇产科相关方面研究第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023161 宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤疾病，具有较高的发病率和病死率，患者五年存活率仅为20%30%1。肿瘤细胞的迁移是人类癌变过程中的关键步骤，因为它构成了转移的病理生理基础，该过程包括恶性细胞与血管内皮粘连，以便侵入周围组织，其中黏附分子在这一过程中起主要作用2。细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion moleclar-1，ICAM-1）是属于 2-整合素家族，有研究显示其在宫颈癌肿瘤细胞中的过度表达与通过粘附内皮细胞的血管侵入有一定相关性，这意味着该分子在转移灶的产生中可能发挥作用3。SKAP1是一种免疫细胞接头蛋白，能通过安排和组装多分子信号复合体来协调淋巴细胞的激活和分化，且 SKAP1 二聚体形成可稳定 SLP-76 微簇并促进粘附4-5。所以 ICAM-1 和 SKAP1 的表达在可能免疫调控机制中发挥重要作用，但是其在宫颈癌中的调控机制至今还未见报道。本研究旨在探索宫颈癌中SKAP1 与 ICAM-1 介导的免疫调控机制，为开发针对该靶点的免疫抑制剂提供理论基础。1 材料与方法1.1 实验动物与细胞 人宫颈癌细胞株 HeLa，购自北京大学人民医院妇产科实验室。雌性 BLAB/c 裸鼠 30 只，5 6 周龄，体质量 18 20 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，动物生产许可：SCXK（沪）2018-0006，在沧州医学高等专科学校动物实验中心饲养，动物使用许可证号 SYXK（冀）2019-006。恒温 18 22，湿度 50%80%，密闭无菌环境。本研究参照中国医学科学院医学实验动物物研究所实验动物使用与管理委员会执行标准。1.2 试剂与仪器 干扰质粒，购自美国 Invitrogen 公司；DMEM高糖培养基，购自美国 Gibco 公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液，购自北京索莱宝公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司；TrizolTM RNA Isolation Reagent 购 自 美 国 GIBCO 公 司；M-MLV reverse transcriptase，购自上海泽叶生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒，购自美国 Genomed 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、免疫组化试剂盒均购自上海雅酶生物医药科技有限公司；DAB 显色试剂盒，购自北京中山生物技术有限公司；鼠抗人 SKAP1 单克隆抗体、鼠抗人 ICAM-1单克隆抗体、鼠抗人 GAPDH 单克隆抗体及辣根过氧化酶标记二抗均购自美国 Abcam 公司；Western blot 化学发光工作液，购自意大利 Cyanagen 公司。OLYMPUS-IX70 倒置相差荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）；Image Station In-Vivo FX 多功能活体成像系统（美国 KODAK 公司）；Light Cycler Nano 实时荧光定量 PCR 仪（瑞士罗氏公司）；全波长扫描酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientifi c 公司）；Image Quant LAS4000mini 成像仪（美国 GE 公司）；BIO-RAD Mini Trans-Blot 垂直电泳/电转系统（美and the tumor growth in each group was recorded.After 30 days,the tumor metastasis was detected by in vivo fluorescence imaging technology.The nude mice were sacrificed,and the tumor tissues were collected.The relative mRNA expression levels of SKAP1 and ICAM-1 in the tumor tissues of nude mice in each group were detected by Real-Time PCR,the protein expression levels of SKAP1 and ICAM-1 were detected by immunohistochemistry,the relative protein expression levels of SKAP1 and ICAM were detected by Western blot,the levels of CD3+,CD4+,and CD8+in the immune cells were detected by flow cytometry,and the levels of Th1 and Th2 cytokines were detected by ELISA.Results The tumor volumes in the three groups were increased with time(P0.05).Compared with the control group and the empty plasmid group,the tumor cell metastasis area,the fluorescence signal intensity,and the relative mRNA and protein expression levels of SKAP1 and ICAM-1 in the tumor tissues of the SKAP1 gene silencing group were signifi cantly decreased(P0.05).Compared with the control group and the empty plasmid group,the levels of CD3+,CD4+,CD4+/CD8+and Th1 cytokines IL-2 and IFN-in the tumor tissue immune cells in the S