PSMD14在胰腺癌中的表...析及对胰腺癌细胞增殖的影响_王悦.pdf

书书书论著 在胰腺癌中的表达分析及对胰腺癌细胞增殖的影响王悦，徐恩君，杨玉萍，王中新安徽医科大学第一附属医院检验科，安徽合肥 摘要：目的探讨蛋白酶体 亚基非 酶（）在胰腺癌中的表达及其与患者预后的关系，并分析其对胰腺癌细胞增殖的影响和潜在机制。方法用基因表达谱交互分析工具（）分析 信使（）在胰腺癌组织中的表达及其与患者预后的关系，并用 （）进一步检测 蛋白在胰腺癌组织和配对癌旁正常组织中的表达情况。对 表达可能参与调控的生物学过程进行基因富集分析。用 小干扰（）和阴性对照 转染胰腺癌细胞系 和 细胞，检测转染效率。通过 试验检测 对细胞增殖的影响。通过葡萄糖摄取试验和乳酸生成试验检测 对细胞糖酵解的影响。通过相关性分析挖掘 可能调控的糖酵解关键酶，并用和反转录实时荧光定量聚合酶链反应（）进行实验验证。结果 数据分析显示：在胰腺癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织（），其高表达与患者预后不良有关（）。与配对的癌旁正常组织相比，蛋白在胰腺癌组织中表达水平升高（）。基因富集分析提示 可能参与调控胰腺癌的细胞增殖。与阴性对照 相比，降低了 和 细胞中的 蛋白表达水平（）。干扰 表达能显著抑制细胞增殖、葡萄 糖 摄 取 和 乳 酸 生 成（）。表 达 与 己 糖 激 酶（）、磷 酸 果 糖 激 酶（）、丙酮酸激酶（）表达呈正相关（、，）。证实干扰 表达只降低 蛋白表达水平（），不影响 和 蛋白表达（），并且 结果显示：干扰 表达不影响 表达水平（）。结论 在胰腺癌组织中高表达，其高表达与患者预后不良有关。有促进胰腺癌细胞糖酵解和细胞增殖的作用，这可能与其增强 蛋白的表达有关。关键词：蛋白酶体 亚基非 酶；去泛素化；细胞增殖；胰腺癌 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：，：，（），（）（）（），国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，基金项目：安徽省高校省级自然科学重点项目（、）。作者简介：王悦，女，技师，主要从事肿瘤免疫的相关研究。通信作者，：。，（）（），（），（），（），（）（），（）（）（，）（），（），（），：，；胰腺癌是一种具有高度侵袭性的肿瘤，严重威胁人类生命健康。胰腺癌发病隐匿，早期诊断困难，仅 的患者确诊时有机会接受手术治疗。绝大多数胰腺癌患者确诊时已处于中晚期，年生存率低至，预后极差。缺乏早期检测手段、肿瘤转移及化疗抵抗等多方面因素是患者预后不良的原因。研究表明，胰腺癌中存在广泛的基因和表观遗传学改变，导致肿瘤驱动基因异常激活。因此，挖掘潜在的肿瘤驱动基因并探索其与胰腺癌的关系将有助于人们认识胰腺癌的进展机制，改善患者预后。泛素化是常见的转录后修饰方式，即泛素分子与底物蛋白赖氨酸残基连接的过程。泛素化的蛋白通常被蛋白酶体识别并降解，而去泛素化则是将泛素分子从底物蛋白移除，从而维持蛋白的稳定性。由于作用底物的多样性，去泛素化酶在多种生物学进程中发挥重要调控作用，与肿瘤的发生密切相关。蛋白酶体 亚基非 酶（）是去泛素化酶中 金属酶（）结构域蛋白酶家族的一员，在卵巢癌、肝癌和头颈癌等多种肿瘤中表达上调。其表达上调与病理高分期、血管侵袭和肿瘤增 殖 等 多 种 预 后 不 良 因 素 有 关 ，而 下 调 表达则能诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和上皮间质转化过程，。在结直肠癌中，通过促进致癌基因 的去泛素化而维持其蛋白稳定性，从而促进结直肠癌细胞增殖和化疗抵抗。在头颈癌中，则介导了 的去泛素化和蛋白的稳定性，从而促进肿瘤的侵袭转移。由此可见 通过作用于多种不同的底物在多种肿瘤中扮演了“促癌”的角色，而其在胰腺癌中的作用及机制尚不清楚。本研究旨在分析 在胰腺癌中的表达情况及与患者预后的关系，并初步探讨其作用于胰腺癌细胞的分子机制。资料与方法一般资料对胰腺癌组织和癌旁正常组织（距离肿瘤边缘 以上）来源于 年月至 年 月于本院进行手术切除治疗并经病理检查确诊为胰腺癌的患者。本研究经安徽医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准。标本来源的患者均对本研究知情同意并签署知情同意书。细胞与试剂胰腺癌 和 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。培养基、胰酶及胎牛血清、培养基为 公司产品，链霉素青霉素双抗为 公司产 品。转 染 试 剂 购 自 公 司，小干扰（）和阴性对照 购自 公司。葡萄糖摄取试验试剂盒、乳酸生成试验试剂盒为 公司产品。试剂盒、组织总蛋白提取试剂盒、裂解液、蛋白定量试剂盒、蛋白上样缓冲液购自碧云生 物 技 术 公 司。、肝 脏 磷 酸 果 糖 激 酶（）抗体购自 公司，己糖激酶（）抗体、丙酮酸激酶（）抗体、抗体购自 国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，公司。膜、增强化学发光液购自 公司。试剂购自 公司。反转录试剂盒、试剂盒购自 公司。方法 表达分析通过基因表达谱交互分析工具（，：）分析 数据库中 在胰腺癌患者癌组织和正常组织中的表达差异，同时分析 表达水平与患者总生存率和无病生存率的关系。对 表达可能参与调控的生物学过程进行基因富集分析，即功能注释和 通路富集分析。（）检测蛋白表达水平将组织进行充分研磨后，使用 试剂在 条件下充分裂解细胞，按照组织蛋白提取试剂盒说明书中的步骤提取总蛋白。用 法测定蛋白浓度，取适量蛋白加入上样缓冲液后于 水浴 使蛋白变性。将处理好的蛋白在 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后电转至 膜，用含牛奶的缓冲液将膜封闭，将 膜与一抗（稀释，稀释，稀释，稀释，稀释）孵育过夜。洗膜（次）后，将膜与二抗（）室温孵育，再洗膜（次），最后用化学发光液显影并用凝胶成像仪拍照。细胞培养和细胞转染人胰腺癌细胞 和 用含双抗、胎牛血清的 培养基，在 、条件下培养。取对数生长期的细胞计数，按 个细胞孔接种于孔板，待细胞融合 度达 时 进 行 转 染。按 照 转染试剂说明书，将 用 无血清培养基稀释，用 无血清培养基稀释，两者混合后加入细胞中，后换液继续培养至。的序列如下，：，：。试验细胞转染 后按 个孔接种于 孔板，每组设置孔，分别培养、，每孔加入 试剂，孵育，酶标仪测定 处吸光度（）值。葡萄糖摄取试验、乳酸生成试验及相关性分析肿瘤细胞常通过增强糖酵解来保证细胞的快速增殖，因此本研究对 是否通过调控胰腺癌细胞的糖酵解来促进细胞增殖进行研究。葡萄糖摄取试验：将转染的细胞以 个孔接种于 孔板中，待细胞贴壁后，更换为无血清培养基使细胞饥饿过夜。洗次，加入脱氧葡萄糖。按照葡萄糖摄取检测试剂盒说明书处理细胞，酶标仪测定 处值（可反映葡萄糖摄取量）。乳酸生成试验：将转染的细胞以 个孔接种于 孔板中，待细胞贴壁后，更换为无血清培养基，于 收集细胞培养上清，离心去除细胞碎片，按照乳酸生成检测试剂盒说明书加入试剂，酶标仪测定 处值（可反映乳酸生成量）。为了进一步探讨 调控细胞糖酵解的机制，通过 分析 与糖酵解限速酶 、表达水平的相关性。提取及反转录实时荧光定量聚合酶链反应（）按照试剂说明用 提取细胞总，并用核酸仪检测 浓度。用 将 反转录为 ，再用 及相应引物对 进行 扩增。反转录及 在 型 仪上进行。引物序列如下，正向为 ，反 向 为 ；正 向 为 ，反向为 。统计学处理采用 软件进行数据统计分析。符合正态分布、方差齐性的计量资料以表示，组间比较采用独立样本检验。采用 生存曲线分析 表达水平与患者生存预后的关系。为差异有统计学意义。结果 在胰腺癌和癌旁正常组织中的表达情况及 与 患 者 预 后 的 关 系 数 据 分 析 显 示：在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织（）。显示：蛋白在胰腺癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织（）。以 表达水平中位数为界，将胰腺癌患者分为 高表达组和低表达组，高表达组的总生存率和无病生存率均明显低于 低表达组（）。见图。基因富集分析功能注释和 通路富集分析显示：表达与细胞增殖的相关功能和通路有关，如 重组、细胞周期的正向调控等，提示 可能影响胰腺癌细胞的增殖。对胰腺癌细胞增殖的作用检测显示：转染 的细胞与转染阴性对照 的细胞相比，蛋白表达水平明显降低（）。试验显示：与转染阴性对照 国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，的细胞相比，转染 的细胞增殖被明显抑制（），说明 可以促进胰腺癌细胞的增殖。见图。注：为 数据中 在胰腺癌组织和癌旁正常组织中的表达水平比较，胰腺癌组织 例，癌旁正常组织 例，表示两组间比较，以 表示的表达水平，纵轴数值为将 进行对数处理后的数值；为检测 蛋白在胰腺癌组织和癌旁正常组织中的表达水平，为标本编号，表示胰腺癌组织，表示癌旁正常组织；为 高、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线。图 在胰腺癌和正常组织中的表达情况及与预后的关系注：为检测各组细胞中 蛋白的表达水平及 蛋白表达水平的比较；为 试验检测细胞的增殖能力；阴性对照表示转染阴性对照 ，表示转染 。图干扰 表达对胰腺癌细胞增殖的影响 促进细胞糖酵解干扰 表达能显著 抑 制 细 胞 的 葡 萄 糖 摄 取 和 乳 酸 生 成（），见图。对糖酵解限速酶表达的影响通过 分析发现 与糖酵解限速酶、的表达水平呈正相关（、，）。检 测 显 示：干 扰 表达能抑制 蛋白的表达（），而对 和 蛋 白 的 表 达 无 明 显 影 响（），说明 可能通过调控 蛋白的表达影响胰腺癌细胞的糖酵解。结果显示：干扰 表达对 表达无明显影响（），提示 可能通过转录后修饰的方式调控 蛋白的表达。见图。注：为葡萄糖摄取试验；为乳酸生成试验；阴性对照表示转染阴性对照 ，表示转染 ；葡萄糖摄取量和乳酸生成量分别由相应的值表示。图干扰 表达对胰腺癌细胞葡萄糖摄取和乳酸生成的影响国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，注：为通过 分析胰腺癌中 与、和 表达水平的相关性，以 表示的表达水平，横纵轴数值为将 进行对数处理后的数值；为 检测各组细胞中 、和 蛋白的表达水平及 蛋白相对表达水平的组间比较；为 检测各组细胞中 的表达水平；阴性对照表示转染阴性对照 ，表示转染 。图 对、和 表达的影响讨论蛋白的泛素化和去泛素化是常见的转录后修饰过程，近年来越来越多的研究证实了其在肿瘤进展中发挥重要的调控作用。是去泛素化酶中 家族成员之一，其在肝癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达上调，而且是影响预后的因素，。本研究首次探讨了 在胰腺癌调控中的分子机制，发现 在胰腺癌组织中表达异常上调，其高表达与患者预后不良有关，这与其在其他多种肿瘤中的促癌作用一致，。既往的研究表明，可通过促进细胞增殖、促进上皮间质转化、介导侵袭转移过程、促进血管侵袭等多种方式促进肿瘤进展，而 导致胰腺癌患者预后不良的分子机制尚不清楚。本研究通过基因富集分析挖掘了 在胰腺癌中可能参与的生物学过程，发现其富集的功能和通路与细胞增殖有关，提示 可能参与调控胰腺癌细胞增殖。进一步的实验验证发现，干扰 表达可抑制胰腺癌细胞增殖。在其他多种肿瘤中，靶向抑制 表达也能明显抑制肿瘤进展。在黑色素瘤中，靶向抑制 可导致 的聚集和锌指转录因子（）的减少，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。等 研究发现，抑制剂可拮抗 信号介导的肿瘤干性，从而逆转化疗抵抗现象。以上研究说明 可能作为肿瘤治疗的潜在靶点。然而，在胰腺癌中 调控细胞增殖的机制尚不清楚，进一步阐明其机制将有助于评估其作为胰腺癌精准治疗靶点的潜力。无氧糖酵解，也称为“效应”，是肿瘤的重要代谢重塑方式之一，肿瘤细胞因此可快速获得能量供给并产生有利于肿瘤生长的微环境。有研究表明，泛素化和去泛素化可调控肿瘤细胞的无氧糖酵解，并导致细胞增殖、迁移和侵袭能力等生物学行为的改变。泛素化酶 通过增加果糖，二磷酸酶（）的泛素化降解而促进细胞糖酵解，导致胰 腺 癌 进 展，去 泛 素 化 酶 通 过 调 控 的去泛素化维持其稳定性，从而促进肺癌细胞的糖酵解。本研究结果显示：干扰 表达能抑制胰腺癌细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成，提示 可抑制细胞糖酵解。等研究发现 可促进卵巢癌细胞糖酵解进而加速肿瘤进展，使用 抑制剂可抑制肿瘤生长，与本研究结果一致。本研究发现，干扰 可抑制胰腺癌细胞增殖，但其对胰腺癌细胞侵袭能力的影响及在体内的效应仍需进一步地研究。研究证实 可催化多种底物的去泛素化过 程，通 过 相