TRIM14对宫颈癌细胞增...充质转化的影响及其作用机制_张贤雨.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan；40（1）TRIM14对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭及上皮间充质转化的影响及其作用机制*张贤雨，马欢，张志林（河北北方学院附属第一医院放疗科，张家口075000）摘要目的：探讨三结构域蛋白14（TRIM14）对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化（EMT）的影响及相关作用机制。方法：收集40例宫颈癌患者的宫颈癌组织及癌旁正常宫颈组织标本，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测TRIM14基因表达。体外培养宫颈癌HeLa细胞，将TRIM14小干扰RNA（si-TRIM14）转染至HeLa细胞。采用CCK-8法检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，Transwell小室法检测细胞侵袭，Western blotting法检测EMT相关蛋白和单磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关蛋白表达。结果：宫颈癌组织中TRIM14 mRNA表达水平显著高于癌旁正常宫颈组织（P0.05）。与si-NC组比较，si-TRIM14组细胞增殖活性、细胞迁移率、侵袭细胞数目均降低，E-cadherin蛋白表达量升高，N-cadherin、Vimentin、Snail1蛋白表达量均降低（P0.05）。si-TRIM14组细胞中p-AMPK/AMPK比值高于si-NC组，p-mTOR/mTOR比值低于si-NC组（P0.05）。结论：TRIM14在宫颈癌组织中高表达，干扰TRIM14表达可通过调控AMPK/mTOR信号通路抑制EMT，进而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。关键词宫颈癌；三结构域蛋白14；迁移；侵袭；上皮间充质转化中图分类号：R737.33文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0101-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.016Effect of TRIM14 on proliferation,migration,invasion and epithelial-to-mesenchymal transi-tion of cervical cancer cells and its mechanismZhang Xianyu,Ma Huan,Zhang Zhilin.(Department of Radiotherapy,The First Affiliated Hospital of HebeiNorth University,Zhangjiakou 075000，China)AbstractObjective:To investigate the effect of tripartite motif-containing protein 14(TRIM14)on prolifera-tion,migration,invasion and epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)of cervical cancer cells and its relatedmechanism.Methods:Cervical cancer tissue and adjacent normal cervical tissue samples of 40 patients with cer-vical cancer were collected and the expression of TRIM14 was detected by real-time fluorescence quantitativepolymerase chain reaction(RT-qPCR).Cervical cancer HeLa cells were cultured in vitro and small interferingRNA(si-TRIM14)was transfected into HeLa cells.Cell proliferation was detected by cell counting kit(CCK-8),cell migration was detected by scratch test,cell invasion was detected by transwell chamber assay,and the expres-sions of EMT related protein and proteins associated with adenosine monophosphate protein kinase(AMPK)/ra-pamycin target protein(mTOR)signaling pathway were detected by western blotting.Results:The expression ofTRIM14 mRNA in cervical cancer tissues was significantly higher than that in adjacent normal cervical tissues(P0.05).Compared with si-NC group,cell proliferation activity,cell mobility and the number of invasive cellsin si-TRIM14 group decreased,the expression of E-cadherin protein increased,and the expressions of N-cad-herin,vimentin and Snail1 protein decreased(P0.05).The P-AMPK/AMPK ratio in si-TRIM14 group washigher than that in si-NC group,and the P-MTOR/mTOR ratio was lower than that in si-NC group(P0.05).Conclusion:TRIM14 is highly expressed in*基金项目：河北省2022年度医学科学研究课题计划（No.20220594）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-02-28 101广西医科大学学报2023 Jan；40（1）cervical cancer tissues,and interfering with the expression of TRIM14 can inhibit EMT by regulating AMPK/mTOR signaling pathway,thus inhibiting the proliferation,migration and invasion of cervical cancer cells.Keywordscervical cancer;tripartite motif-containing protein 14;migration;invasion;epithelial-to-mesenchy-mal transition宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的第二大原因。尽管学者们在宫颈癌诊断及治疗手段方面做了大量探索研究，宫颈癌患者的预后仍不理想，1年生存率仅为10%20%1-2。宫颈癌患者生存率低、复发率高等不良预后与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关3。因此，揭示肿瘤转移的分子机制，开发新的肿瘤治疗靶点意义重大。上皮间充质转化（EMT）是指极化的上皮细胞在形态学上转变为具有运动能力的间质细胞，可增强细胞转移、侵袭能力4。大量研究发现，EMT过程参与癌细胞扩散和转移，肿瘤微环境、缺氧、炎症等因素通过调控EMT转录因子和钙黏蛋白的表达影响肿瘤细胞侵袭、转移5-7。三重基序蛋白（TRIM）家族是泛素E3连接酶最大的亚家族之一，可控制肿瘤的发生和进展。三重基序蛋白 14（TRIM14）是TRIM家族的一个成员，已被证明是一种重要的癌基因。TRIM14在肝细胞癌、结肠癌、乳腺癌、骨肉瘤等多种肿瘤中的表达上调，TRIM14过表达可促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药等8。最近的研究表明，TRIM14可能通过调节单磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径促进胃癌细胞的自噬和化疗耐药，提示TRIM14介导的AMPK/mTOR信号转导通路在肿瘤发展中扮演着重要角色9。贺敏等10研究发现，TRIM14在子宫内膜癌组织和细胞系中均高表达，其高表达与患者不良预后、淋巴结转移等具有相关性；同时，TRIM14可能通过EMT调控子宫内膜癌细胞侵袭和转移。而TRIM14在宫颈癌中的作用及其对宫颈癌细胞EMT的影响目前尚不明确。因此，本研究旨在探讨TRIM14对宫颈癌细胞迁移、侵袭及EMT的影响及其对AMPK/mTOR信号通路的调控作用。1材料与方法1.1一般资料收集2019年7月至2021年7月在本院接受宫颈癌切除术的40例患者的宫颈癌组织及癌旁正常宫颈组织标本，患者年龄（53.4610.16）岁，术前均未接受放、化疗。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均自愿签署知情同意书。1.2实验材料人宫颈癌HeLa细胞株购自武汉普诺赛生命科技公司；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自南京生航生物技术公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；TRIM14小干扰RNA（si-TRIM14）及小干扰RNA阴性对照（si-NC）购自上海吉玛制药技术有限公司；TRIzol试剂、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒、反转录试剂盒均购自赛默飞世尔科技（中国）公司；Transwell 小室、Matrigel基质胶均购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、增强化学发光试剂（ECL）、结晶紫染液均购自北京索莱宝生物公司；兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cad-herin）、波形蛋白（Vimentin）、锌指转录因子Snail1多克隆抗体购自北京中杉金桥生物试剂公司；兔抗人 AMPK、磷酸化 AMPK（p-AMPK）、mTOR、磷酸化mTOR（p-mTOR）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP-DH）多克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自英国abcam公司。1.3细胞培养将人宫颈癌HeLa 细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37、5%CO2的恒温培养箱中传代培养。1.4细胞转染与分组取对数生长期HeLa细胞，按1105个/mL的密度接种于6孔板，培养24 h后，利 用 Lipofectamine 2000 转 染 试 剂 分 别 将 si-TRIM14和si-NC转染至HeLa细胞，记为si-TRIM14组和si-NC组，同时设置空白对照组（Control组：正常培养细胞）。转染48 h后以RT-qPCR法检测转染效率。1.5RT-qPCR 法检测宫颈癌组织和 HeLa 细胞中TRIM14 mRNA 表达收集经过研磨的宫颈癌组织、癌旁正常宫颈组织以及转染处理的HeLa细胞悬液，以TRIzol试剂提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。采用反转录试剂反转录合成cDNA，行RT-qPCR扩增实验。引物序列如下：TRIM14 上 游：5-GGATTTGTGTCTCCGTTCTG-1023，下 游：5-TCTGTCTGCCTGGTATTCTG-3；GAPDH 上游：5-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3，下游：5-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3。反应条件：95 1 min，95 30 s，60 45 s，72 30 s，进行40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2CT法分析目的基因表达水平。1.6CCK