PDZK1基因启动子区rs...汉族男性人群痛风发病的关系_何爽.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 3 期PDZK1基因启动子区rs12129861位点基因多态性与新疆汉族男性人群痛风发病的关系何爽1，夏依代 图尔荪1，孙红光1，刘璐2，叶飞1，王宇婷3，李瑞4，苗蕾11 新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐830000；2 新疆医科大学附属第一医院；3 新疆生产建设兵团疾控中心；4 新疆医科大学基础医学院摘要：目的了解PDZ蛋白激酶1（PDZK1）基因启动子区rs12129861（A/G）位点的基因型和基因频率与新疆地区汉族男性人群痛风发病的关系。方法收集汉族男性痛风患者（痛风组）和同时期体检健康者（对照组）的血样，采用多重荧光PCR技术检测PDZK1基因启动子区rs12129861（A/G）位点的基因型。比较两组rs12129861（A/G）位点的基因型分布及基因频率以及不同rs12129861（A/G）位点的基因型人群血清尿酸浓度。选择KpnI、XhoI双酶切位点，构建含rs12129861（A/G）位点的pGL3-promotor荧光素酶表达载体，采用双荧光素酶报告基因实验证实启动子区rs12129861（A/G）位点是否影响荧光素酶基因的表达。结果PDZK1基因启动子区rs12129861（A/G）位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡性检验（P0.05），该位点稳定遗传具有群体代表性。痛风组和对照组PDZK1基因启动子区rs12129861（A/G）位点AA、GA、GG基因型分布频率差异有统计学意义（2=14.633，P0.01），等位基因A和G分布频率的差异有统计学意义（2=14.236，P0.01），其中痛风组等位基因G的分布频率高于对照组，OR值为1.661。rs12129861（A/G）位点基因型为A/A与G/G人群间、G/A与G/G人群间血清尿酸浓度比较，P0.05，其中基因型为G/G的人群血尿酸浓度大于基因型A/A、G/A人群。双荧光素酶实验结果显示，rs12129861（A/G）具有增强子功能，rs12129861（G）重组质粒的荧光素酶报告基因表达水平低于 rs12129861（A）重组质粒（P0.05），and the stable inheritance of this locus was population representative.There were statistically significant differences in the distribu 论著 基金项目：国家自然科学基金项目（81460153）。第一作者简介：何爽（1997-），女，在读硕士，主要研究方向为痛风及相关疾病诊治。E-mail：通信作者简介：苗蕾（1981-），女，副教授，硕士生导师，主要研究方向为痛风及相关疾病诊治。E-mail：1山东医药2023 年第 63 卷第 3 期tion frequencies of AA，GA and GG genotypes at rs12129861（A/G）locus in PDZK1 gene promoter region between the gout group and control group（2=14.633，all P0.01），the difference of allele A and G distribution frequency was statistically significant（2=14.236，P0.01），the distribution frequency of allele G in the gout group was higher than that in the control group，and the OR value was 1.661.Significant difference was found in the serum uric acid concentration between the population with genotype A/A and genotype G/G，and between the population with genotype G/A and genotype G/G at rs12129861（A/G）locus（both P0.05）.The serum uric acid concentration of G/G genotype was higher than those of A/A genotype and G/A genotype.The results of double luciferase assay showed that rs12129861（A/G）had enhancer function，and the luciferase reporter expression level of rs12129861（G）was lower than that of rs12129861（A）（P0.05）.Conclusion The genotype and gene frequency of rs12129861 in the promoter region of PDZK1 gene are associated with gout in Xinjiang Han male population，and allele G may be a risk factor for gout.Key words：gene single nucleotide polymorphism；rs12129861 single nucleotide polymorphism；PDZ protein kinase 1；gout痛风是一种炎症性关节炎，由于血清尿酸（SUA）水平过高，导致关节内尿酸钠结晶沉积从而引发的炎症性疾病1。近年痛风患病率正在逐渐升高2，有资料显示，中国部分地区的痛风患病率已达2.6%3。在所有国家中男性的痛风患病率明显高于女性，是女性的26倍4。痛风受到众多因素的影响，除了已知的环境因素如高嘌呤饮食、饮酒和吸烟外，遗传因素也参与痛风的发生，识别遗传因素对于提高痛风的病因诊断和治疗是必要的5。全基因组关联分析（GWAS）研究6表明，普通人群的痛风发展与常见的基因突变有关。单核苷酸多态性（SNP）是人类可遗传变异中最为常见的一种，在所有已知的可遗传变异中占比高达90%，在多因素疾病研究中具有重要意义。大量的研究发现了与痛风疾病发病存在相关的许多SNP7。PDZ 蛋白激酶 1（PDZK1）是一种已在肾脏、肝脏、小肠和肾上腺皮质中发现的细胞骨架蛋白，其并不直接参与血尿酸的转运，而是与许多尿酸转运蛋白相互作用以控制尿酸转运8-9。人PDZK1基因位于 lq21，存在多个 SNP 位点，某些功能性位点的变异可以影响 PDZK1 蛋白的表达。rs12129861 位点位于PDZK1基因上游约2 kb，可能会影响PDZK1的基因表达水平，不同个体rs12129861基因型的不同可能导致尿酸盐转运体转运效率的不同10。GWAS 显 示，尿 酸 浓 度 的 个 体 差 异 可 能 使 得PDZK1基因产生变异，从而导致个体间痛风发病率的 不 同10。以 上 提 示 PDZK1 基 因 启 动 子 区rs12129861位点可能与痛风发病相关，可能通过影响尿酸转运体的功能导致尿酸转运效率的差异。新疆乌鲁木齐市汉族男性痛风是否与PDZK1基因启动子区 rs12129861 位点的 SNP 有关目前仍未见报道，本研究以新疆乌鲁木齐市301例汉族男性痛风患者与 514 例汉族男性体检健康人群作为研究对象，对PDZK1 基因启动子区rs12129861（A/G）位点等位基因和基因型分布频率进行分析，并比较了所有研究对象中不同基因型人群的尿酸浓度，以明确rs12129861（A/G）位点SNP多态性是否与痛风发生存在关联，并采用双荧光素酶报告基因实验证实启动子区 rs12129861（A/G）位点是否影响荧光素酶基因的表达。1 资料与方法 1.1临床资料收集20182020年在新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院、新疆维吾尔自治区中医医院就诊的汉族男性痛风患者301例（痛风组），年龄（47.64 12.48）岁，入选者符合国际风湿病学会（ACR）2015年制定的痛风分类标准；同时选择同时期在上述三家医院体检的男性体检健康者514例（对照组），年龄（46.15 13.15）岁，两组间年龄差异无统计学意义（P0.05）。痛 风 组 尿 酸（512.85 134.00）mol/L、葡萄糖（5.82 1.86）mmol/L、尿 素 氮（5.72 3.68）mmol/L、肌酐（96.22 54.28）mol/L、甘油三酯（1.99 1.53）mmol/L、总 胆 固 醇（4.57 1.11）mmol/L，收缩压（125.56 13.34）mmHg、舒张压（81.11 11.12）mmHg。对照组尿酸（344.70 55.05）mol/L、葡萄糖（5.34 1.19）mmol/L、尿素氮（5.83 15.27）mmol/L、肌 酐（85.90 13.00）mol/L、甘油三酯（1.71 1.17）mmol/L、总胆固醇（4.65 0.89）mmol/L，收缩压（124.66 13.31）mmHg、舒张压（76.25 9.51）mmHg。痛风组尿酸、葡萄糖、肌酐、甘油三酯以及舒张压值高于对照组（P均0.05。本次研究经新疆医科大学公共卫生学院伦理委员会批准，所有受试者在纳入研究前均给予知情同意。1.2PDZK1基因启动子区rs12129861位点基因型分析采用多重荧光 PCR 法。研究对象禁食 12 h后于清晨采集空腹静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用全血基因组DNA提取试剂盒（北疆百泰克公司）提取DNA，使用紫外分光光度仪进行定量，琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，质检合格的样本稀释至50 ng/L，放于-80 冰箱保存。在NCBI数据库中查询到 rs12129861（A/G）位点的序列信息，利用Primer 6.0 软件设计引物，由上海天昊公司合成。上游引物序列：5-GCTGTTGTTGTTGTTGTTG-3，下游引物序列：5-GGCAGGAGAATCACTTGAA-3。PCR 反应条件：在 20 g/L 琼脂凝胶电泳中，95 min94 20 s65 40 s72 1.5 min，共11个循环，94 20 s59 30 s72 1.5 min，24个循环，72 2 min。扩增结束后，由上海天昊公司采用SNP分型技术对所有样本进行rs12129861（A/G）位点基因多态性及基因的分型分析。1.3PDZK1 基因启动子区 rs12129861（A/G）位点活性的检测采用双荧光素酶报告基因实验。查阅NCBI 数据库，得到 rs12129861 位点的序列具体信息，采用基因合成法合成基因，然后以合成基因为模板进行基因扩增得到长度大约为 1 013 bp 的 DNA片段。基因扩增反应条件：95、5 min，95、30 s，55、2 min，72、1 min，25个循环。基因扩增后的产物和pGL3-promotor质粒用T4 DNA连接酶（TaKaRa 公 司）置 于 16 连 接 0.51 h，获 得 pGL3-rs12129861（A/G）-promotor重组质粒。将重组质粒加入装有TOP10感受态细胞的离心管中，在管中加入 SOC 液体培养基使细胞复苏、表达 PDZK1 基因rs12129861位点，然后接种到LB培养基（含Ap抗生素）上。培养1216 h后筛选菌落进行基因扩增验证，对目的基因序列进行基因测序，结果证明重组质粒构建成功。将胰酶消化过的 HEK293T 细胞用10%DMEM 完全培养基按照每孔 0.51052105个细胞的密度接种在24孔细胞板上，于含5 CO2的37 温箱中孵育824 h，细胞完全