JAK1_STAT1信号通...缺血再灌注损伤中的作用机制_宋光捷.pdf

JAK1/STAT1 信号通路在白藜芦醇减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用机制宋光捷1方毅1陈黎2冯建青3(1 湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院神经内科，湖北襄阳441000;2 中国人民解放军联勤保障部队第九九一医院骨科;3 中国人民解放军 96608 部队医院内一科)摘要 目的探究白藜芦醇(es)基于 Janus 激酶(JAK)1/信号转导与转录激活子(STAT)1 信号通路减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法采用大脑中动脉栓塞(MCAO)法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并将大鼠随机分为假手术(Sham)组、脑缺血再灌注(I/)组、es 低剂量组(10 mg/kg)、es 中剂量组(30 mg/kg)和 es 高剂量组(60 mg/kg)各 8 只，观察各组神经功能缺失评分、脑梗死体积、脑水肿率，并以 T-聚合酶链反应(PC)检测 B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3 mNA 表达水平，以 Western 印迹检测 Bcl-2、Bax、caspase-3 和 JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1 蛋白表达水平。结果I/组神经功能缺失评分显著高于 Sham 组，脑梗死体积、脑水肿率显著大于 Sham 组，阳性神经元数量显著多于 Sham 组，Bcl-2 mNA 和蛋白表达水平显著低于 Sham 组，Bax、caspase-3 mNA 和蛋白表达水平显著高于 Sham 组，p-JAK1、p-STAT1 蛋白表达水平显著高于 Sham 组(均 P0.05);予以 10、30、60 mg/kg 剂量 es 处理后，es 低剂量组与 I/组相比无明显变化(P0.05)，es 中、高剂量组神经功能缺失评分显著低于 I/组，脑梗死体积、脑水肿率显著小于 I/组，阳性神经元数量显著少于 I/组，Bcl-2 mNA 和蛋白表达水平显著高于 I/组，Bax、caspase-3 mNA 和蛋白表达水平显著低于 I/组，p-JAK1、p-STAT1 蛋白表达水平显著低于 I/组(均 P0.05)，各组 JAK1、STAT1 蛋白表达水平相比无明显变化(P0.05)。结论es 处理可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，其机制可能是通过抑制 JAK1/STAT1 信号通路，降低其磷酸化水平，进而影响凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、caspase-3 表达有关。关键词 Janus 激酶 1/信号转导与转录激活子 1;白藜芦醇;局灶性脑缺血;再灌注损伤中图分类号 743 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0700-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.048基金项目:湖北省自然基金资助项目(2017CCV063)通信作者:方毅(1987-)，女，硕士，主治医师，硕士生导师，主要从事脑血管疾病研究。第一作者:宋光捷(1979-)，女，主治医师，主要从事癫痫、痴呆等研究。缺血性脑卒中是全世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，尽管大量的神经保护剂被不断研究和开发，但仍未取得满意的效果1。缺血性脑卒中在溶栓治疗过程中，极有可能出现脑缺血再灌注损伤，进而造成神经细胞损伤或促进神经元凋亡2。因此，深入了解缺血再灌注所导致的氧化应激损伤机制，为缺血性脑卒中提供新的治疗方法，具有十分重要的意义。Janus 激酶(JAK)1 是 Janus 激酶家族中的成员之一，存在于细胞膜表面，信号转导与转录激活子(STAT)1 是 STAT 家族中的成员之一，存在于细胞质中，JAK1/STAT1 信号通路在细胞生长、凋亡中起着关键的调控作用3。机体一旦出现应激反应，细胞膜表面的 JAK1 被异常激活，随后STAT1 被 JAK1 激酶的细胞质酪氨酸激酶磷酸化，进而启动细胞凋亡等一系列信号通路4。研究表明5，抑制 JAK1/STAT1 信号通路可抑制小胶质细胞的激活，减轻缺血性脑损伤。白藜芦醇(es)是一种多酚类化合物，存在于葡萄、桑葚、花生和葡萄酒中，被认为是一种有效的抗氧化、抗感染和抗凋亡药物6。研究表明7，8，es 对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，但其详细作用机制有待进一步阐明。本研究探讨 es 基于 JAK1/STAT1 信号通路减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用机制。1材料与方法1.1药品、试剂和仪器es(纯度98%，北京索莱宝科技有限公司);10%水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂);2%的 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(上海泽叶生物科技有限公司);4%多聚甲醛(中国医药集团上海化学试剂公司);免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);IPA 裂解液、蛋白酶抑制剂(北京博奥森生物技术有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白质浓度测定试剂盒、电化学发光(ECL)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所);鼠抗 JAK1 单克隆抗体、鼠抗 STAT1 单克隆抗体(英国 Abcam 公司;辣根过氧化酶标记羊抗鼠 IgG(北京中杉金桥生物有限公司)。007中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷1.2实验动物健康、清洁级 SD 雄性大鼠 40 只，8 10 周龄，体重 260 300 g，由南京君科生物工程有限公司提供，合格证号:SCXK(苏)2019-0002。所有大鼠喂养于标准环境中，控制温度为 22 24，并使其自由摄取食物和水。动物研究均严格按照国家卫生研究所和医院动物伦理委员会所批准的实验动物护理和使用指南执行。1.3模型建立和分组适应性喂养所有大鼠 1 w，并将大鼠随机分为假手术(Sham)组、脑缺血再灌注(I/)组、es 低剂量组(10 mg/kg)、es 中剂量组(30 mg/kg)和 es 高剂量组(60 mg/kg)各8 只。采用文献介绍的大脑中动脉栓塞(MCAO)法以建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，步骤如下，首先采用1 ml/100 g的 10%水合氯醛溶液对大鼠进行腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于手术台上，从颈正中行一切口，使得右侧颈总动脉暴露，并游离颈内动脉及颈外动脉，于颈外动脉距离颈总动脉交叉位置 10 mm 处结扎、离断，使用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，并于颈外动脉距离颈总动脉交叉位置 5 mm 处作出一个小切口，将线栓(直径 0.24 mm)经切口插入颈内动脉，结扎颈外动脉，将颈内动脉的动脉夹松开，继续将线栓插入到达右侧大脑中动脉，当线栓顶端距离颈总动脉分叉位置 18 20 mm 且感觉到有阻力时停止，并松开颈总动脉动脉夹，等到大鼠苏醒之后进行 Longa 神经功能缺失评分，2 分则判断为栓塞成功，2 h 后将线栓退到颈外动脉残端位置以实现再灌注，假手术组不插入线栓，并注射生理盐水，es 低、中、高剂量组于再灌注前通过大鼠尾部进行静脉注射 10、30、60 mg/kg剂量的 es。1.4方法1.4.1各组神经功能缺失评分再灌注 24 h 之后，参照 Zea Longa 评分标准对其神经功能缺损进行评分，采用 4 级评分法，0 分:无神经功能缺失;1 分:轻度缺失，提尾时右前肢无法完全伸展;2 分:中度缺失，向右侧转圈;3 分:中至重度缺失，向右侧倾倒;4 分:重度缺失，意识丧失，甚至出现死亡。1.4.2各组脑梗死体积和脑水肿率测定再灌注24 h 之后，取 10%水合氯醛麻醉各组大鼠，断头取脑组织，均匀切成 2 mm 厚度冠状切片，并浸入 2%TTC 溶液中，并置于 37恒温水浴锅中孵育30 min，再浸入 4%多聚甲醛中固定 24 h，取出脑切片平铺于培养皿中，并拍照，利用 ImageJ 软件测定脑梗死体积。使用电子天平测定大鼠左、右两侧大脑湿重，置入 100烤箱 24 h，再测定干重，脑水肿率=(脑组织湿重脑组织干重)100%。1.4.3免疫组化染色检测凋亡相关蛋白表达取各组脑组织进行石蜡包埋切片，常规脱蜡水化，再置于苏木素中染色 5 min，清水冲洗，再水化 15 s，清水冲洗，再放入 75%酒精、85%酒精各2 min，再置于0.5%伊红中染色 1 min，再次放入 95%酒精、和 100%酒精、中各 5 min 及二甲苯、中各5 min，最后，采用中性树胶封片，并在显微镜下观察脑组织形态变化。1.4.4原位细胞凋亡检测法(TUNEL)检测缺血再灌注区脑神经元凋亡水平取各组缺血再灌注区脑组织切片，常规脱蜡，滴加 20 g/ml 不含 DNA 酶的蛋白酶 K 50 l，置于 37烤箱孵育 30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗 3 次，5 min/次，再加入 TUNEL检测液 50 l，37 烤箱孵育 1 h，PBS 漂洗 3 次，5 min/次，最后使用抗荧光淬灭封片液在显微镜下进行观察。1.4.5T-聚合酶链反应(PC)检测 mNA 表达取各组缺血再灌注区脑组织，采用 NA 提取试剂盒提取总 NA，并采用反转录试剂盒将 NA 样品反转录成 cDNA，引物序列如下:GAPDH 正向:5-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3，反向:5-CAAAGTT-GTCATGGATGACC-3;B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2 正向:5-AGGATTGTGGCCTTCTTTGA-3，反向:5-CAGAT-GCCGGTTCAGGTACT-3;Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)正向:5-GCTGGACACTGGACTTCCTC-3，反 向:5-ACTCCAGCCACAAAGATGGT-3;含半胱氨酸蛋白水解 酶(caspase)-3 正 向:5-TGCCAGAAGATAC-CAGTGGA-3，反向:5-TGACTGGATGAACCATGAC-C-3。引物由南京金斯瑞公司进行合成。最后采用SYB 试剂盒进行 T-PC 检测。1.4.6Western 印迹检测蛋白表达取各组缺血再灌注区脑组织 100 mg 提取蛋白，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将分离胶转移至与目的蛋白区域大小对应的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，放入电泳槽进行转膜，加入一抗 Bcl-2(1 500)、Bax(1 500)、caspase-3(1 500)、JAK1(1 500)、STAT1(1 500)、p-JAK1(1 500)、p-STAT1(1 500)孵育 4 过夜，TBST 缓冲液清洗 3 次，各5 min，加入辣根过氧化酶标记的二抗 IgG(1 1 000)室温孵育 1 h，TBST 缓冲液清洗 3 次，各5 min，最后滴加 1 1混匀的 A 液和 B 液，以 GAPDH 作为内参，将膜放入凝胶成像系统中，拍照，并采用 ImageJ 软件分析。1.5统计学分析采用 SPSS20.0 软件进行单因素方差分析。107宋光捷等JAK1/STAT1 信号通路在白藜芦醇减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用机制第 3 期2结果2.1es 对 I/大鼠神经功能的影响I/组神经功能缺失评分显著高于 Sham 组(P0.01)，提示大脑中动脉栓塞后局部脑组织缺血，导致了明显的神经功能缺失;es 低剂量组神经功能缺失评分与 I/组相比无明显变化(P0.05)，es 中、高剂量组神经功能缺失评分显著低于 I/组(P0.01)，其中es 中剂量组改善效果最佳。见表 1。2.2es 对 I/大鼠脑梗死体积和脑水肿率的影响I/组脑梗死体积、脑水肿率显著大于 Sham 组(P0.01)，es 低剂量组脑梗死体积、脑水肿率与I/组相比无明显变化(P0.05)，es 中、高剂量组脑梗死体积、脑水肿率显著小于 I/组(P0.05)，表明 30、60 mg/kg 剂量的 es 处理可显著降低 I/大鼠脑梗死体积、脑水肿率。见表 1、图 1。表 1各组神经功能缺失评分、脑梗死体积百分比、脑水肿率、神经元凋亡及脑组织 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mNA 表达比较(xs，n=8)组别脑梗死体积百分比(%)脑水肿率(%)神经功能缺失评分(分)神经元凋亡(个)Bcl-2