RIPK3介导的巨噬细胞M...化在结直肠癌肝转移中的研究_高辉.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan；40（1）RIPK3介导的巨噬细胞M2型极化在结直肠癌肝转移中的研究*高辉1，殷玉敬2，孙志慧3（包头市肿瘤医院1.肿瘤综合内科；2.病理科；3.泌尿外科，内蒙古包头014030）摘要目的：探究受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIPK3）介导的巨噬细胞M2型极化在结直肠癌肝转移（CRLM）中的作用及其相关机制。方法：收集CRLM患者结肠肿瘤及其癌旁组织，对肿瘤组织进行病理分析。通过RT-qPCR法检测RIPK3、CD68、精氨酸酶-1（Arg-1）表达量。采集CRLM患者和结肠癌患者外周血，通过流式细胞术检测巨噬细胞分型，利用ELISA检测血清白介素（IL）-1、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-4、转化生长因子-（TGF-）、IL-10含量。使用慢病毒将PLK-RIPK3和PLK-NC转染至THP-1细胞，采用PMA/IL4诱导为M2型巨噬细胞，通过RT-qPCR和Western blotting检测两组细胞极化程度。将两组细胞分别与人结肠癌细胞系WiDr共孵育，检测WiDr细胞迁移、侵袭变化和结肠癌相关转移1（MACC1）、原癌基因MYC（c-MYC）表达情况。结果：CRLM患者结肠肿瘤病理结构符合肠腺癌肝转移。与癌旁组织相比，RIPK3在CRLM肿瘤组织表达降低，CD68、Arg-1表达增加。与结肠癌患者相比，CRLM患者外周血中富集更多的M2型巨噬细胞，血清中IL-4、TGF-、IL-10含量增加，IL-1、iNOS含量减少。与WiDr+PLK-NC-THP-1组相比，WiDr+PLK-RIPK3-THP-1组被诱导为M2型巨噬细胞的程度减少，对WiDr细胞的促迁移和侵袭能力降低，MACC1、c-MYC表达量减少。结论：RIPK3表达降低通过诱导巨噬细胞向M2型极化，促进结直肠癌细胞MACC1、c-MYC表达和肿瘤转移。关键词结直肠癌；肝转移；丝氨酸/苏氨酸激酶3；免疫抑制性细胞；巨噬细胞中图分类号：R735文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0071-08DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.012RIPK3-mediated M2-type polarization of macrophages in colorectal cancer liver metastasisGao Hui1,Yin Yujing2,Sun Zhihui3.(1.General Department of Oncology;2.Pathology Department;3.Depart-ment of Urology,Baotou Tumor Hospital,Baotou 014030,China)AbstractObjective:To study the role of M2-type polarization in macrophages mediated by receptor interact-ing serine/threonine kinase 3(RIPK3)in colorectal cancer liver metastasis(CRLM)and its related mechanisms.Methods:Colon tumors and their paracancer tissues were collected from CRLM patients for pathological analy-sis.The expressions of RIPK3,CD68 and Arg-1 were detected by real-time fluorescence quantitative polymerasechain reaction(RT-qPCR).The peripheral blood of CRLM and colon cancer patients was collected,and the mac-rophage typing was detected by flow cytometry.Serum levels of interleukin-1,IL-6,inducible nitric oxide syn-thase(iNOS),IL-4,transforming growth factor-(TGF-)and IL-10 were detected by ELISA.PLK-RIPK3 andPLK-NC were transfected into THP-1 cells by lentivirus,and M2-type macrophages were induced by PMA/IL4.The polarization degree of the two groups of cells was detected by RT-qPCR and western blotting.The twogroups of cells were co-incubated with human colon cancer cell line WiDr,respectively;the migration,invasionchanges and expression of metastasis associated in colon cancer 1(MACC1)and MYC proto-oncogene(c-MYC)of WiDr cells were detected.Results:The pathological structure of colon tumors in CRLM patients was consis-tent with liver metastasis of intestinal adenocarcinoma.Compared with paracancer tissues,the expression ofRIPK3 in CRLM tumor tissues decreased while theexpressions of CD68 and Arg-1 increased.Comparedwith colon cancer patients,the peripheral blood of*基金项目：吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金（No.320.6710.2019-11-07）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-06-14 71广西医科大学学报2023 Jan；40（1）CRLM patients was more enriched with M2-type macrophages;the serum contents of IL-4,TGF-and IL-10 in-creased while the contents of IL-1 and iNOS decreased.Compared with the WiDr+PLK-NC-THP-1 group,theWiDr+PLK-RIPK3-THP-1 group was less induced into M2 macrophages;the ability to promote migration and in-vasion of WiDr cells and the expressions of MACC1 and c-MYC decreased.Conclusion:The expression of re-duced RIPK3 promotes the expressions of MACC1 and c-MYC and tumor metastasis in colorectal cancer cellsby inducing M2-type polarization of macrophages.Keywordscolorectal cancer;liver metastasis;receptor interacting serine/threonine kinase 3;immunosuppres-sive cells;macrophages结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的致死性恶性肿瘤，2018年全球癌症数据显示，CRC是全球癌症相关死亡的第三大原因，复发转移率高1。其中发生肝转移的概率约为50%，结直肠癌肝转移（colorectal liver metastasis，CRLM）患者对治疗应答疗效差，5年生存率仅10%。CRC是典型的炎症相关性肿瘤，炎症性肠病被认为是CRC的癌前病变2。CRLM中肿瘤免疫微环境中浸润的免疫细胞，包括M2型巨噬细胞及其分泌因子的存在，是导致肿瘤免疫耐受及治疗失败的最重要的原因3-4。因此，通过探寻可能有效的免疫治疗靶点调控免疫抑制细胞的表型进而改变其功能，抑制免疫耐受将有助于CRC的临床研究治疗。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶 3（receptorinteracting serine/threonine kinase 3，RIPK3）作 为RIP家族的主要成员，参与细胞的程序死亡5。近期研究表明缺乏RIPK3可通过调节包括M2型巨噬细胞在内的免疫抑制性细胞（myeloid-derived suppres-sor cells，MDSC），从而加速CRC的发生和发展6，但并没有探讨对CRC转移的作用。CRLM患者疗效差，RIPK3是否可通过募集M2型巨噬细胞及相关细胞因子，从而预测CRLM患者治疗疗效的预后尚不清楚。因此，本课题拟通过检测CRLM患者血清炎症因子和循环系统中巨噬细胞分型，分析RIPK3与CRLM患者的相关性，为提高CRLM治疗疗效及改善预后寻找新的突破点。1对象与方法1.1研究对象和材料1.1.1样本来源收集2018年3月至2021年3月，在本院行切除手术的结肠癌中患者的肿瘤及其癌旁组织（距肿瘤边缘3 mm）共60例。其中30例符合CRLM标准。组织样品置于-80 冰箱保存。入组患者抽取外周血标本，分离血清，-80 冰箱保存。患者及家属均签署知情同意书。（1）CRLM纳入标准：病理诊断 CRLM 的患者；肝功能：Child-Pugh A或B7分，ECOG为01分。（2）排除标准：入组前接受过系统治疗（包括化疗、分子靶向、免疫治疗）；1个月内接受过包括手术、放疗、TACE等任何形式抗肿瘤治疗；合并活动性消化道出血或临床严重感染；严重心、肺、肾等器官疾病；排除肝硬化凝血功能障碍、脾功能亢进所致外周血粒细胞降低和/或血小板降低患者。本研究已获本院伦理委员会批准。1.1.2主要材料人单核细胞株THP-1和人结肠癌细胞株WiDr购自中科院上海细胞库；DMEM和RPMI1640培养基和牛血清蛋白（FBS）购自Giboco公司；白介素（IL）-1、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-4、转化生长因子-（TGF-）、IL-10 ELI-SA试剂盒购自Abcam公司；PLK-NC、PLK-RIPK3慢病毒购自吉凯基因公司；SYBR Green 试剂、TRIzol 试剂、逆转录试剂盒和 ECL 显色液均购自Vazyme公司；PMA、Matrigel购自美国Sigma公司；Transwel购自康宁公司；CD86抗体、CD206抗体、CD68抗体均购自BD公司；RIPK3抗体、GAPDH抗体购自Proteintech公司；RIPK3、CD68、精氨酸酶-1（Arg-1）、结肠癌相关转移 1（MACC1）、原癌基因MYC（c-MYC）、GAPDH引物由通用生物合成。1.2方法1.2.1细胞培养使用含10%胎牛血清，且添加抗生素的RPMI 1640培养基培养WiDr细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培基培养THP-1细胞。于37、5%C