LINC00665通过le...癌细胞增殖与侵袭的机制研究_张博超.pdf

LINC00665 通过 let7i/HMGA1 促进肝癌细胞增殖与侵袭的机制研究张博超1，浦春1，2，蒋平2，朱萍1，刘静文2，李政2，石敏2(皖南医学院 1第一附属医院检验科;2检验学院，安徽芜湖241002)摘要:目的探讨 LINC00665 通过 let7i/HMGA1 对肝癌细胞增殖与侵袭能力的影响。方法通过 qTPC 分析LINC00665 在肝癌组织中的表达情况。选择人肝癌细胞 Hep3B 和 Huh7 细胞，分别将其分为 siNANC 组、siNALINC00665组、let7i mimicsNC 组、let7i mimics 组进行转染;采用 qTPC 和 Western blot 检测各组的 HMGA1 mNA 和蛋白水平;CCK8 法检测各组细胞的增殖活力;划痕实验检测各组细胞的划痕愈合率;Transwell 实验检测各组细胞的侵袭数量。结果LINC00665 在肝癌组织中的表达量显著高于正常组织。hep3B 和 Huh7 细胞转染 48 h 后，与 siNC 组相比，siLINC00665 组细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降，HMGA1 的 mNA 和蛋白水平下降，let7i 的表达水平升高;与 let7i mimicsNC 组相比，let7i mimics 组细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降，HMGA1 的 mNA 和蛋白水平下降。结论LINC00665 通过 let7i/HMGA1 途径，在肝癌进展中调控肿瘤增殖和侵袭作用，LINC00665 有望成为临床肝癌治疗的新靶点。关键词:LINC00665;let7i;HMGA1;肝癌;增殖;侵袭中图分类号:7357文献标识码:A文章编号:10017550(2023)01001007基金项目:国家自然科学基金项目(81772180);安徽省教育厅省级自然科学重点项目(KJ2016A722);安徽省大学生创新训练项目(s202110368042)作者简介:张博超(1995)，男，硕士研究生，检验师，研究方向:肿瘤标志物研究。通讯作者:浦春，教授，研究方向:免疫学和分子生物学。LINC00665 target let7i/HMGA1 promote the proliferation and invasion of hepatoma cellsZHANG Bochao et al(Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of LINC00665/let7i/HMGA1 on the proliferation and invasion of hepatomacellsMethodsThe expression of LINC00665 in hepatocellular carcinoma was analyzed by qTPCHuman hepatoma cells Hep3Band Huh7 were selected and divided into siNANC，siNALINC00665，let7i mimicsNC，let7i mimics groupsQTPC andWestern blot were used to detect the levels of HMGA1 mNA and protein in each transfection groupThe proliferation activity of trans-fected cells was detected by CCK8 methodThe scratch healing rate of transfected cells was detected by scratch testTranswell assay wasused to detect the number of invasion cells in each group after transfectionesultsThe expression of LINC00665 in hepatocellularcarcinoma was significantly higher than that in normal tissues48 hours after Hep3B and Huh7 cells were transfected，compared with siNC group，the cell proliferation，migration and invasion ability of siLINC00665 group were decreased，and the mNA and proteinlevels of HMGA1 in cells were decreased，the expression level of let7i was increasedCompared with the let7i mimicsNC group，the proliferation，migration and invasion abilities of the let7i mimics group were decreased，and the mNA and protein levels of HM-GA1 in the let7i mimics group were decreasedConclusionLINC00665 plays a tumor promoting role in the progression of liver cancerthrough let7i/HMGA1 pathwayLINC00665 is expected to become a new target for clinical hepatocellular carcinoma treatmentKey words:LINC00665;let7i;HMGA1;hepatocellular carcinoma;proliferation;invasion肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大常见肿瘤，多数患者发现时已到中晚期，且死亡率较高1。手术切除和肝移植仅适用于肝癌早期患者，且预计5 年总生存率为40%左右，而到了肝癌中晚期后，放疗和化疗等治疗效果十分局限2。因此在肝癌的早期诊断、临床治疗和预后评估中，在分子水平上对肝癌发病机制的研究就显得十分必要。一些学者通过对肝细胞癌组织样本进行基因测序发现，众多的 NA 在组织样本中表达失调，其中就包括长链非编码 NA(Long noncoding NA，ln-cNA)。lncNA 长度超过 200 个核苷酸，具有多种生物功能，如参与转录因子的调控、染色质重构、干扰 mNA 剪接等许多过程34。研究证实在多种恶性肿瘤中 lncNA 参与调控癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及肿瘤耐药。LINC00665 是一种新型长链012023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023DOI:10.13799/ki.mdjyxyxb.2023.01.020非编码 NA，长度为 18657bp，位于 19q1312，被发现在多种肿瘤中表达上调5。Let7i 是 let7 家族的一员，在多种肿瘤组织中低表达，对肿瘤细胞生长、增殖的侵袭产生抑制作用68。高迁徙率族蛋白 A1(HMGA1)是一种与染色质结合的蛋白质，可以编码构架性染色质转录因子，该转录因子可以结合在转录调控序列上改变 DNA 结构，进而调控基因的转录9。HMGA1 在多种恶性肿瘤组织和细胞系中表达上调，并与恶性肿瘤进展、不良预后和远处转移密切相关1011。本研究将 LINC00665 作为研究对象，验证 LINC00665 对肝癌细胞增殖和侵袭的影响，并进一步验证 LINC00665 通过 let7i/HMGA1途径在肝癌细胞中的影响机制。1材料和方法11材料和设备人肝癌细胞株 Hep3B 和 Huh7购自武汉普诺赛生物科技有限公司;人胚肾细胞HEK293T 由广州吉赛公司提供;胎牛血清(FBS)购自 Gibco 公司;Hyclone DMEM 高糖培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。HMGA1、let7i、LINC00665 引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司;siNANC、siNALINC00665、let7i mimics、let7i mimicsNC 及转染试剂 riboFECTTM CP 购自广州锐博生物技术有限公司;逆转录和定量 PC 试剂盒购自天北京天根生化科技有限公司;羊抗兔 IgG购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人单克隆抗体 HMGA1 购自 Abcam 公司、兔抗人单克隆抗体 actin 购自 Cell Signaling Technology 公司;Western blot测定仪器购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。逆转录仪器为 Eppendorf Mastercycler nexus PC 仪;定量测定的仪器为 LightCycler 96 荧光定量 PC 仪。12方法121临床标本收集收集皖南医学院第一附属医院弋矶山医院确诊为肝细胞性肝癌组织样本 11对(癌组织和癌旁正常组织)，且均为 HBV 阳性。所有肝癌样本均经过术后组织的病理诊断。122细胞的培养Hep3B、Huh7 和 HEK293T 细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置于 37，5%CO2的培养箱中培养。123细胞转染和分组取生长状态和密度良好的 Hep3B 和 Huh7 细胞接种于六孔板，24 h 后，使用riboFECTTM CP 按照试剂说明书进行细胞转染。转染 siNC 建立 siNC 组、转染 siLINC00665 建立 siLINC00665 组、转染 let7i mimicsNC 建立 let7imimicsNC 组、转染 let7i mimics 建立 let7i mim-ics 组。实验均设 3 个复孔。124细胞中总 NA 的提取、逆转录和荧光定量PC采用 Trizol 试剂(碧云天，上海碧云天生物技术有限公司)提取细胞中总 NA，用分光光度法确定提取总 NA 的纯度，进行逆转录和定量测定。HMGA1、let7i 和 LINC00665 的实时荧光定量 PC引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;let7i 的反向引物序列由天根试剂盒(北京)提供。将GAPDH 作为内参，采用 2Ct法计算 HMGA1 m-NA 和 LINC00665 的相对表达水平。将 U6 作为内参，采用 2Ct法计算 let7i 的相对表达水平。引物序列见表 1。表 1TqPC 引物扩增序列基因名称序列(5 3)LINC00665 FCATCCGTCCACCGGACTCGTLINC00665 TGGCACTCCCCCCTACAAGCMiLet7i FGCCGCGTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTU6 FCGCTTCGGCACATATACHMGA1 FCGAAGTGCCAACTAAGAGACCHMGA1 GATGCCCTCCTCTTCCTCCTTCTCGAPDH FCATCAAGAAGG TGGTGAAGCAG3GAPDH GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG125蛋白质提取和 Western blot放射免疫沉淀法(IPA，碧 云 天)裂 解 缓 冲 液 和 苯 甲 磺 酰 氟(PMSF，碧云天)按照 1 99 的比例配制，冰上提取六孔板内细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定各蛋白样本的浓度。取 40 g 蛋白经过 12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE，碧云天)电泳，90