R钙粘蛋白抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和转移_谢健.pdf

中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-09-06 修回日期2022-12-09基金项目福建省教育厅青年教师教育科研项目JT180206作者简介谢健，女（1987 年），汉族，硕士，主治医师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：R 钙粘蛋白抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和转移谢健1,2,3*，曾德华4（1福建医科大学附属口腔医院预防科，福州 350002；2福建医科大学附属口腔医学院，福州 350004；3福建省口腔医院口腔医学重点实验室，福建医科大学，福州 350004；4中国人民解放军联勤保障部队第九医院病理科，福州 350000）摘要目的 明确 R 钙粘蛋白（R-cadherin，R-cad）在涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）中的作用。方法 首先通过免疫组织化学染色比较 R-cad 在涎腺腺样囊性癌组织和癌旁正常涎腺组织中的表达差异。之后，选取涎腺腺样囊性癌高转移细胞株 SACC-LM,通过 siRNA 干扰技术有效下调 R-cad 表达，通过迁移小室迁移实验和侵袭小室侵袭实验以及裸鼠肺转移瘤模型实验，检测 R-cad 表达下调后，SACC-LM 细胞迁移和侵袭能力的改变。结果 免疫组织化学染色显示，相对于癌旁正常涎腺组织，R-cad 在涎腺腺样囊性癌组织中的表达量降低；迁移小室和侵袭小室实验证明，R-cad 表达下调后，SACC-LM 细胞的迁移能力和侵袭能力增强；裸鼠肺转移瘤模型实验证明，R-cad 表达下调的 SACC-LM 细胞在裸鼠体内形成更多的肺转移灶。结论 在涎腺腺样囊性癌中 R-cad 可能有抑制涎腺腺样囊性癌细胞迁移、侵袭和远处转移的作用。关键词R 钙粘蛋白；涎腺腺样囊性癌；转移；侵袭；中图分类号R365 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.006R-cadherin inhibits the invasion and metastasis of salivary adenoid cystic carcinomaXie Jian1,2,3*,Zeng Dehua4(1Department of Preventive Dentistry,School and Hospital of Stomatology,Fujian Medical University,Fuzhou 350002,China;2School of Stomatology Affiliated to Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China;3 Key Laboratory of Stomatology of Fujian Province,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China;4Department of Pathology,900TH Hospital of Joint Logistics Support Force,Fuzhou 350000,China)AbstractObjective To clarify the role of R-cadherin-4(R-cad)in the salivary adenoid cystic carcinoma.Methods First,the expression of R-cad in salivary adenoid cystic carcinoma and normal salivary gland adjacent to carcinoma was compared by immu-nohistochemical staining.After that,SACC-LM,a highly metastatic cell line of salivary adenoid cystic carcinoma,was selected to effectively reduce the expression of R-cad through siRNA interference technology.The changes of migration and invasion ability of SACC-LM cells after the down-regulation of R-cad expression were detected through Transwell migration and invasion experiments and nude mouse lung metastatic tumor model experiment.Results Immunohistochemical staining showed that the expression of R-cad in salivary adenoid cystic carcinoma was lower than that in normal adjacent salivary gland tissues;Transwell experiments showed that the migration and invasion ability of SACC-LM cells increased after the down-regulation of R-cad expression;the nude mouse lung metastatic tumor model experiment proved that SACC-LM cells with down-regulation of R-cad expression formed more lung metastat-ic foci in nude mice.Conclusion R-cad may inhibit the migration,invasion and distant metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma cells.KeywordsR-cadherin;salivary adenoid cystic carcinoma;migration;invasion涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcino-ma）是一个发生率较低的头颈部肿瘤，发病率约为1%1。涎腺腺样囊性癌常发生于腮腺和小唾液腺，也可发生于下颌下腺2。其进展较缓慢，患者的5年生存率约为 60%，但该疾病存在嗜神经性和早期远处转移的特点，并且远处转移灶常为肺部，所以患者常易出现神经症状并出现早期转移3-5。目前腺样囊性癌的治疗还是以手术伴或者不伴局部放疗为主，还没有标准的全身系统性化疗方案6。该疾病复发率较高，30%的复发患者是远处转移灶的复发，远中国组织化学与细胞化学杂志576第 31 卷处转移灶复发时可以伴随或不伴随原发灶复发7。钙粘蛋白（cadherin，CDH）家族是钙依赖性的亲同性细胞黏附分子，依赖于二价的钙离子发生作用。它存在机体的各个地方，目前已发现的有 30 多个家族成员8。钙粘蛋白主要功能是介导细胞间连接、增强细胞间黏附、参与正常组织形成与分化、调节细胞的迁移运动和相关通路等。不仅如此，钙粘蛋白被发现与多种肿瘤的发生和进展有关9-13。哺乳动物中常见的钙粘蛋白分子为 CDH1 基因编码的 E 钙粘蛋白、CDH2 和 CDH12 基因编码的 N 钙粘蛋白、CDH4 编码的 R 钙粘蛋白（R-cadherin，R-cad）和 CDH5 编码的 VE 钙粘蛋白等。E 钙粘蛋白主要存在于着床前的胚胎、上皮细胞中；P钙粘蛋白主要分布于心，肺，小肠以及胚胎滋养层；N 钙粘蛋白主要分布于神经系统、心和肺中；R-cad 主要存在于视网膜神经细胞、神经胶质细胞14-17。此外，很多研究表明钙粘蛋白家族和癌症的发生发展存在着千丝万缕的联系18-21。目前关于涎腺腺样囊性癌的靶向治疗药物有伊马替尼，西妥昔单抗等，但是效果不佳，效果较好的有靶向血管内皮因子受体（VEGFR）的药物，缓解率为 11%16%和 9.17%，但是目前还在临床二期实验中。因为R-cad本身在多种肿瘤中被发现存在显著功能，在实验组的前期研究中也发现 R-cad 可能和涎腺腺样囊性癌的侵袭转移相关，但具体的作用尚不明确，所以深入研究 R-cad 和涎腺腺样囊性癌的关系，研究其作为治疗靶点的可行性，具有积极的意义22。材料与方法1 临床资料与组织标本涎腺腺样囊性癌样本30例和癌旁正常涎腺组织样本 22 例，均由中国人民解放军联勤保障部队第九医院病理科提供。2 细胞培养高转移涎腺腺样囊性癌细胞系（SACC-LM）从北京大学医学部基础医学院获得。细胞在含有 15%胎牛血清（Gibco BRL,Grand Island,NY）的1640培养基（Gibco BRL，Grand Island，NY）中，在 37、5%CO2、湿润空气培养箱中培养。取对数生长期细胞用于分析。3 合成 siRNA为了靶向下调 R-cad 的表达，设计并合成 R-cad特异 siRNA（siRNA-1 和 sRNA-2）和对照 siRNA（siRNA-NC）（上海基因制药有限公司）敲低 CDH4表达，序列信息见表 1。使用 Lipofectamine RNAi-MAX 转染法将相应 siRNA 转染到 SACC-LM 细胞。表 1 R-cad siRNA 及对照 siRNA 序列Tab.1 The sequences of R-cad siRNA and its control siRNAsiRNA 名称正义链序列序列反义链序列序列siRNA-15-CAGUCGACUACGAGCUCAATT-35-UUGAGCUCGUAGUCGACUGTT-3siRNA-25-GCGACAACAUCCUCAAGUATT-35-UACUUGAGGAUGUUGUCGCTT-3siRNA-NC5-UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-35-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3表 2 实时荧光定量 RT-PCR 引物序列Tab.2 The sequences of real-time RT-PCR primers基因正向序列反向序列GAPDH5-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-35-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3CDH45-CGTCCATCATCAAAGTGAAGGT-35-GGTCGTAGTCCTGGTCCTCTCT-34 实时荧光定量 PCR收集 6 孔板中培养的 SACC-LM 细胞（每孔约有 5105个细胞），使用 Trizol 试剂（Invitrogen，USA）提取其总RNA。使用PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒（Takara，日本），将提取的 RNA 逆转录为cDNA。用Terra qPCR Direct TB Green Premix（Takara，日本）进行实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析。R-cad 的对应基因 CDH4 和内参基因 GAPDH的引物序列见表 2。qRT-PCR 反应如下：95 变性2 min，然后在 95 变性 15 s，60 变性 30 s，95 变性 15 s，如此循环 40 次。谢健等.R 钙粘蛋白抑制涎腺腺样囊性癌的侵袭和转移第 6 期 5775 蛋白免疫印迹10%SDS-PAGE 分离提取的总蛋白（30 g）并将其转移至 PVDF 膜（Amer