NLRC3低表达对人肺正常...EAS-2b侵袭迁移的影响_李杰.pdf

江西医药2022年11月 第57卷 第11期Jiangxi Medical Journal，November 2022，Vol 57，No11摘要：目的探讨NLRC3（NLR family CARD domain containing 3）低表达后对人肺正常上皮细胞株BEAS-2b侵袭和迁移的影响及其机制。方法采用Lipofectamin 2000转染试剂将NLRC3基因的小干扰片段siNLRC3转染至BEAS-2b细胞；荧光定量PCR检测干扰片段siNLRC3的干扰效率；Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验检测NLRC3低表达后BEAS-2b细胞迁移和侵袭能力的变化；Western Blot检测NLRC3低表达后基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、钙粘蛋白E-cadherin表达的影响。结果荧光定量PCR实验结果表明siNLRC3干扰效率为77%。Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验结果表明NLRC3低表达后BEAS-2b细胞迁移和侵袭能力增加（P0.05）。Western blot结果显示NLRC3低表达后BEAS-2b细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平上调，E-cadherin蛋白表达水平明显下降（P0.01）。结论 NLRC3基因低表达后可能通过降低E-cadherin蛋白表达以及促进MMP-2、MMP-9蛋白表达来增强BEAS-2b细胞的侵袭和转移能力。关键词：NLRC3；BEAS-2b；侵袭；迁移中图分类号：R734.2文献标识码：B文章编号：1006-2238(2022)11-1718-05DOI：10.3969/j.issn.1006-2238.2022.11.003The Effect of low expression of NLRC3 on invasion and migration of human lung normal epithelial cells BEAS-2b LI Jie,LIU Ling,HUANG Youxing,LU Hongfei,LUO YaolingAbstract：Objective To investigate the effect and mechanism of low expression of NLRC3(NLR family card domain contain-ing 3)on invasion and migration of human normal lung epithelial cell line BEAS-2b.Methods The small interfering RNA of theNLRC3 gene(siNLRC3)was transfected into BEAS-2b cells using Lipofectamin 2000 transfection reagent.The interference effi-ciency of siNLRC3 was detected by RT-qPCR.The migration and invasion of BEAS-2b cells after low expression of NLRC3 wasdetected by Transwell.Western Blot was used to detect the expression of matrix metalloproteinase-2,matrix metalloproteinase-9(MMP-2,MMP-9)and E-cadherin after the expression of NLRC3 was decreased.Results The results of RT-qPCR showed thatthe interference efficiency of siNLRC3 was 77%.Transwell assay showed that the migration and invasion ability of BEAS-2b cellsincreased after low expression of NLRC3(P0.05).Western blot analysis showed that the expression of MMP-2 and MMP-9 inBEAS-2b cells was up-regulated and the expression of E-cadherin was significantly decreased(P0.01)after low expression ofNLRC3.Conclusions The low expression of NLRC3 may enhance the invasion and metastasis of BEAS-2B cells by reducing theexpression of E-cadherin and promoting the expression of MMP-2 and MMP-9.Key words:NLRC3;BEAS-2B;invasion;migrationNLRC3 低表达对人肺正常上皮细胞BEAS-2b 侵袭迁移的影响李杰1，刘裬2，黄铀新1，卢洪飞1，罗耀玲1（1.赣南医学院第一附属医院；2.赣南医学院，赣州 341000）基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目，编号 180818通信作者:罗耀玲 实验研究 肺癌（lung cancer）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其病死率占恶性肿瘤的第一位，被认为是对人类生命和健康威胁最大的肿瘤1。尽管现在肺癌在诊断、分期和治疗方法上有了很大进步，前景并没大幅度改变，在过去的十年里总的5年生存率只有轻微的增加（从15.7%到17.4%）2。NLRC3是NLR家族一员，它能够抑制NF-B控制的主要炎性通路3-5。近年来研究发现，NLRC3有潜在的抑癌作用6-8，有望成为人类癌症的预防和治疗的新靶点。课题组前期研究发现NLRC3在肺癌组织中的表达明显低于癌旁组织。该课题进一步从细胞和分子水平研究NLRC3与肺癌发生发展的关系，通过小RNA干扰技术，使NLRC3在BEAS-2b细胞内低表达，观察低表达NLRC3对细胞侵袭和转移的影响和初步机制。1材料与方法1.1材料 人肺正常上皮细胞株BEAS-2b细胞购自中科院上海细胞生物研究所细胞库；RPMI-1640培养基、胎牛血清（GIBCO）；青链霉素溶液（索莱宝）；Lipofectamine 2000；RIPA裂解液（上海碧云1718江西医药2022年11月 第57卷 第11期Jiangxi Medical Journal，November 2022，Vol 57，No11天）；TRIZOL（Invitrogen）；荧光定量PCR试剂盒（bio-rad）；Matrigel（BD）；Transwell小室（costa）；E-cadherin、MMP-2、MMP-9抗体购自Abcam公司，-actin一抗及相关二抗购自中杉金桥公司；干扰片段siNLRC3、阴性对照序列（siNC）由生工生物（上海）股份有限公司设计合成。1.2方法1.2.1细胞培养 人肺正常上皮细胞BEAS-2b培养于RPMI-1640培养液（含10胎牛血清和1%青链霉素溶液）；于37、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。细胞贴壁生长覆盖达80-90%左右时将细胞进行传代培养。后续实验所用细胞均是取处于对数生长期的细胞，活细胞数达95%以上。1.2.2 BEAS-2b细胞的siRNA转染方法的确定 取对数生长期的BEAS-2b细胞，胰酶消化、计数，按1.5105cells/孔来接种于6孔培养板，每孔加入2mL完全培养基。待融合度达50%左右进行转染，将LipofectamineTM2000与荧光FAM标记的阴性siRNA片段（FAM-siNC）按照不同比例进行转染，转染4 h后荧光显微镜下观察转染效率，以确定最佳转染方法（参照siRNA转染说明书进行）。1.2.3荧光定量PCR验证干扰效果转染方法同前。实验分为3组：未转染组（UT）、siNC组、siNL-RC3组，每组做2个平行孔。未转染组用等量PBS代替转染试剂，转染4 h后更换成完全培养基继续培养24 h，然后用Trizol提取每孔总RNA，逆转录cDNA后进行荧光定量PCR：NLRC3上游引物：5GACATGAAGGCGTTTGGTGT-3，下游引物：5GCCATAGTAATACGCGGCTG-3，长度为153bp；内参-actin上游引物：5TATCCAGGCTGTGC-TATCCC-3，下游引物：5-CCATCTCTTGCTC-GAAGTCC-3，长度为320bp。qRT-PCR条件为：94预变性10min；94变性15s，60退火30s并收集荧光，共40个循环。数据采用相对定量法，以2-Ct来进行分析，Ct=Ct目的Ct内参，Ct=Ct实验组-Ct对照组。1.2.4 Transwell检测低表达NLRC3对BEAS-2b迁移能力的影响 细胞分组、接种及转染方法同前，转染4 h后更换成完全培养基继续培养24 h。然后收集各组的细胞，计数，用含0.1%BSA的无血清培养基重悬，调节细胞浓度为1106个/mL。吸取各组细胞悬液200 L加入水化后的Transwell小室中，再通过间隙向下腔加入600L含5FBS的培养基，将培养板置于37、5%CO2培养箱继续培养24h；随后取出Transwell小室，用无菌棉签擦去小室中的细胞，PBS洗3遍再放回原孔中，下腔加入60 L5 g/L的MTT，继续培养4 h后，弃上清，加DMSO600 L，振荡10min充分溶解结晶，测A570nm值。1.2.5 Matrigel检测低表达NLRC3对BEAS-2b侵袭能力的影响按迁移实验方法分组及转染细胞。将基质胶Matrigel进行1:8稀释，取80 L Matrigel包被Transwell小室，置于培养箱内2 h使Matrigel聚集成凝胶。将转染24 h的BEAS-2b细胞，消化、离心收集细胞，用0.1%BSA无血清培养基重悬，计数，调整细胞密度为1106个/mL，每组细胞悬液分别取200 L接种到小室，另将600 L含10%FBS的1640培养液加到下室；继续常规培养24 h。待培养结束后取出Transwell小室，无菌棉签拭去小室内未发生侵袭转移的细胞并用PBS洗涤3遍，甲醇固定20 min，0.1%结晶紫溶液染色15 min，PBS缓冲液轻轻洗3次。显微镜下随机取5个视野计数侵袭转移细胞数量，重复3次取均数。1.2.6 Western blot检测低表达NLRC3对E-cad-herin、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响 按迁移实验方法分组及转染细胞。转染48h后弃上清，并用PBS洗涤2遍，6孔板中每孔加入500 L蛋白裂解液，置冰上作用30min，期间用移液器反复吹打，以便细胞充分裂解。然后将裂解液全部转移到1.5 mL离心管中，以4 12000 rpm离心5 min，上清液即为含总蛋白的溶液。蛋白定量（以便统一上样量）后，煮沸，上样（总蛋白约30 g）；然后经电泳、切胶、转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜等过程。最后用ECL发光并在bio-rad凝胶成像仪上成像，并对条带进行灰度值分析。1.3统计学分析 运用SPSS18.0软件对数据进行统计分析，结果以（xs）表示；多组数据间的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比 较 若 方 差 齐 采 用LSD法，方 差 不 齐 采 用TamhanesT2(M)。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1荧光显微镜筛选转染效率FAM-siNC转染4h后于荧光显微镜下观察转染效果。结果比例为100pmol5 L组的细胞在荧光镜下激发出绿色荧光的