microRNA125a-...层细胞功能的调控作用及机制_刘倩.pdf

：实验研究【收稿日期】；【修稿日期】【基金项目】国家自然科学基金青年项目（）【作者简介】刘倩，女，湖北襄阳人，博士研究生，妇产科学专业（通讯作者）对滋养层细胞功能的调控作用及机制刘倩，张琦，谢青贞（武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 ）【摘要】目的观察 （）在滋养层细胞中的表达，探讨其对滋养层细胞增殖、侵袭和凋亡的调控及机制。方法荧光实时定量 检测人滋养层细胞系 、绒癌细胞系 和 中 的表达情况。以 和 细胞为实验对象，分为组：空白对照组（组），未做任何处理；阴性对照组（组），转染 ；实验组（组），转染 。以 、流式细胞仪、法分别检测细胞的侵袭、凋亡及增殖能力。检测 蛋白表达情况及 、磷酸化水平。荧光实时定量 检测 水平，免疫共沉淀法检测 活性水平。结果 表达水平在 、和 细胞中依次降低，两两比较均有统计学差异（）。抑制 和 中 后，细胞的凋亡水平明显降低，侵袭和增殖能力均明显升高（）；和蛋白的表达及活性水平均明显升高（）；及 的磷酸化水平均不同程度增加（）。结论本研究首次在滋养层细胞中检测到 的表达。通过作用于 和 信号通路可抑制滋养层细胞的增殖、侵袭，促进其凋亡。【关键词】；滋养层细胞；酪氨酸激酶；细胞外信号调节激酶（）；信号传导和转录激活因子（）【中图分类号】【文献标识码】，【】：（），：，：（）；（），；（），：，（），生殖医学杂志 年月第 卷第期 ，（），（），（）：；（）；（）（，（）：）胚胎着床是人类和胎生动物生殖生理过程中的一个重要环节，绝大多数的妊娠丢失被认为发生于胚胎着床期间。滋养层细胞在胚胎着床和整个妊娠过程中具有重要作用，其功能失调会导致胚胎着床失败、自然流产、妊娠滋养层细胞疾病等妊娠相关性疾病的发生。然而滋养层细胞功能的调控机制至今仍未完全明确。（）是一类非编码的小 ，在蛋白质的转录后表达过程中发挥重要作用。其中，（）在抑制细胞增殖分化、侵袭等活动方面具有重要作用，并在多种肿瘤细胞中异常表达。在生殖方面，被指出参与了卵母细胞的成熟过程。细胞外信号调节激酶（）等信号传导通路的活化也受到 的调控。我们的前期研究首次发现滋养层细胞中存在 的表达，后者可调控滋养层细胞的功能（未发表数据）。被证实可通过与 端的非翻译区相结合，直接抑制 的表达和活性，其对细胞活动的影响至少部分依赖于 的作用。因此，本研究拟进一步检测 在不同滋养层细胞系中的表达特点，并从滋养层细胞行为角度探索 的作用及相关机制，以进一步了解胚胎着床过程及滋养层细胞功能调控，为相关妊娠并发症的诊治提供新依据。材料和方法一、细胞系人滋养层细胞系 ，绒癌细胞系 和 均购自 （），培养在、条件下。二、主要试剂和仪器 、胎牛血清、胰酶 溶液（）、青霉素链霉素混合液、均购自美国 公司，购自美国 公司，（）、均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，及阴性对照、引物、引物、引物均来源于上海捷瑞生物工程有限公司，购自美国 公司，细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自美国 公司（），小室和 基质胶均购自美国 公司，细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物，裂解液、蛋白浓度测定试剂盒、蛋白琼脂糖均购自上海碧云天生物技术有限公司，抗 兔多克隆抗体购自杭州贤至生物有限公司，抗 兔单克隆抗体、抗信号传导和转录激活因子（）兔单克隆抗体、抗 鼠单克隆抗体、抗 兔单克隆抗体均购自英国 公司，抗 兔单克隆抗体购自美国 公司，标记羊抗小鼠二抗和 标记羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司，通用酪氨酸激酶测定试剂盒购自日本 公司。实时荧光定量 仪购自美国 公司，红外荧光扫描成像系统购自美国 公司，奥利巴斯光学显微镜 购自日本 公司，多功能酶标仪 购自美国 公司，流式细胞仪购自美国 公司。三、实验方法实时荧光定量 ：法提取细胞中的总 ，分光光度计检测纯度。按照 试剂说明合成 ，采用 的 、引物、和 混合物构成 反应体系，计算目的基因的生殖医学杂志 年月第 卷第期相对表达量。所用引物序列如下：正向 引 物：，反 向 引 物：；茎 环 引 物：；正 向 引 物：，反向引物：；正 向 引 物：，反 向 引 物：；正向引物：，反向引物：。细胞转染及分组：细胞培养于 恒温培养箱中，胰 蛋 白 酶 消 化 传 代。选 取 指 数 生 长 期 的 、细 胞，待 细 胞 融 合 度 约 为 时，利用 进行分组转染：（）空白对照组（组），未做任何处理；（）阴性对照组（组），转染 ；（）实验组（组），转染 。转染后换液，转染 后收集各组细胞以备检测。法检测细胞增殖情况：取指数生长期的细胞以 孔接种于 孔板，转染 后，每孔加入 ，培养，酶标仪测定 波长下各孔吸光值（）。法检测细胞侵袭能力：分别收集各组细胞，无血清培养基稀释细胞浓度至 。无血清培养基稀释 胶至终浓度 。孔板中预先加入 预冷 的培养基（含双抗），并放入 小室，在 小室上室底部中央垂直加入 胶，温育 使其干成胶状，后在 上室分别加入 各组细胞悬液，、培养。乙醇固定细胞，结晶紫染色。倒置光学显微镜下，随机选择个 倍视野，计算侵袭细胞数。流式细胞仪检测细胞凋亡情况：用培养基调整指数生长期的细胞密度到 ，接种于孔板，每孔 细胞悬液，转染 后按照 细胞凋亡检测试剂盒进行操作。同时设阴性对照，即正常细胞不加 和 ；阳性对照，以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照，只加 单标；阳性对照，以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照，只加 单标。流式细胞仪上机检测，以 和 双阳、单阳细胞视为凋亡细胞。检测蛋白表达：细胞裂解后提取总蛋白，法测定总蛋白浓度。通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳（）分离蛋白，并通过电印迹转移到聚偏氟乙烯（）膜。室温下，脱脂奶粉封闭，一抗孵育，过夜。漂洗后，标记二抗室温孵育。显影，曝光，分析胶片灰度值。免疫共沉淀法检测 活性：将总细胞裂解蛋白液与 蛋白 琼脂糖珠混合，混合物 离心 ，取上清液，加入 靶向 特异性抗体，室温孵育，再加入 蛋白琼脂糖，室温孵育 。使用通用酪氨酸激酶测定试剂盒，依照说明书测定 激酶活性。四、统计学分析应用 软件进行数据分析。每项实验设置个平行组，数据以均数标准差（?）表示，采用单因素方差分析联合 检验进行各组间比较。表示差异具有统计学意义。结果一、在种不同细胞系中的表达水平采用实时荧光定量 检测 、和 细胞中 的表达，结果显示，相对表达水平在 、和 细胞中依次降低，以 细 胞 为 参 照，分 别 为（）、（）和（），组间比较均有统计学差异（）（图）。与 组比较，；与 组比较，。图 在不同细胞系中的表达生殖医学杂志 年月第 卷第期二、干预对其在滋养层细胞中表达水平的影响干预实验以 表达最高的 细胞系和 表达最低的 细胞系为实验对象，转染 后，实时荧光定量 检测滋养层细胞中 表达水平。和 细胞中 组 的相对表达水平显著低于空白对照组（组）及阴性对照组（组）分别为（）（）（），（）（）（），（图）。：细胞；：细胞。与其他两组比较，。图 细胞和 细胞转染 后的表达抑制三、对 滋 养 层 细 胞 增 殖 能 力 的影响 检测结果显示，转染 后滋养层细胞的增殖能力增 强（图）。细 胞 的 增 殖 率，组 为（），组为（），组则升高至（），组与其他两组比较具有统计学差异（）。细胞的增殖率，组为（），组为（），组则升高至（），与其他两组比较，。图 对滋养层细胞增殖能力的影响 组与其他两组比较具有统计学差异（）。四、对 滋 养 层 细 胞 侵 袭 作 用 的影响 小室实验结果显示，细胞系中 转染细胞的侵袭数量较 组和 组显著增加（）（）（），；细胞系中 组的细胞侵袭数量较 组和 组显著增加（）（）（），（图）。五、对滋养层细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，抑制后，滋养层细胞的凋亡数量减少（图）。细胞的凋亡率，组为（），组为（），组则下降至（），组与其他两组比较具有统计学差异（）。细胞的凋亡率，组 为（），组 为（），组则为（），组与其他两组比较具有统计学差异（）。生殖医学杂志 年月第 卷第期：不同处理下滋养层细胞相对侵袭数量：与其他两组比较，。：各组 小室实验结果：图中蓝紫色显示为迁移到下层的细胞。图 对滋养层细胞侵袭能力的影响：不同条件下滋养层细胞凋亡情况的流式细胞散点图；：各组细胞的凋亡率：与其他两组比较，。图 对滋养层细胞凋亡的影响生殖医学杂志 年月第 卷第期六、对滋养层细胞中 的表达和活性的影响 和 细 胞 进 行 转 染 实 验后，检测 的 和蛋白表达，以及活性变化。结果显示，转染组中 的 和蛋白表达量明显增加，活性水平亦明显升高（图）。细胞中 相对表达水平：组 为（），组 为（），组 上 升 至（），组与其他两组相比有显著性差异（）；细胞中 蛋白相对表达量：组（）显著高于 组（）和 组（）（）；细胞中 的活性水平：组（）细胞 显著高于 组（）细胞 和 组（）细 胞（）。细 胞 呈 现 出 类 似 的 改 变，组 相对表达水平（）显著高于 组（）和 组（）（）；蛋白相对表达量（）显著高于 组（）和 组（）（）；活性水平（）细胞 显著高于 组（）细胞 和 组（）细胞（）。：检测 蛋白水平；：实时荧光定量 检测 水平；：免疫共沉淀检测 活性水平。与其他两组比较，。图抑制 后 和蛋白表达及活性变化七、对滋养层细胞中相关信号通路的影响采用 检测抑制 后滋养层细胞中相关信号通路 和 的磷酸化水平，以评估 是否可通过 通路对滋养层细胞的功能发挥调控作用。如图显示，转染 后，及 的 磷 酸 化 水 平 均 不 同 程 度 增 加。细胞中 转染组中的 和 磷酸化比值为（生殖医学杂志 年月第 卷第期 ）、（），分别显著高于 组的（）和（）以及 组的（）和（）（）；细 胞中 转 染 组 中 的 和 的 磷 酸 化 比 值 为（）、（），分别显著高于 组的（）和（）以及 组的（）和（）（）。：不同条件下各蛋白的代表性 条带；：不同条件下 的磷酸化水平；：不同条件下 的磷酸化水平；与其他两组比较，。图 对滋养层细胞中 信号通路的影响讨论滋养层细胞是一类特殊的上皮细胞，具有强大的侵袭能力。妊娠过程中，滋养层细胞对子宫的侵袭过程类似肿瘤的浸润转移，但与肿瘤细胞不同，滋养层细胞的活动同时受到刺激因子和抑制因子的调控而具有时空特异性和自限性。滋养层细胞自身、子宫上皮和基质细胞、子宫自然杀伤细胞及巨噬细胞等产生的各类因子均可调控滋养层细胞的行为及功能，酪氨酸激酶 、等多条信号通路参与其中。各因素维持动态平衡是保证滋养层细胞发挥正常功能的关键。滋养层细胞功能异常与胚胎着床失败、自然流产、妊娠滋养层细胞疾病、子痫、胎儿宫内生长受限等妊娠并发症的发生相关。人胎盘可不同程度地表达大量 ，滋养层细胞是其主要来源。使用 阵列等高通量测序方法已在正常人类胎盘中鉴定出 多种 。同样，从胎盘分离的滋养层细胞中也检测到 种 ，其中大约一半明显表达，部分特异性表达于人胎盘，且这些 的表达随着妊娠时期的变化而改变。在胎盘中的时间表达模式提示其在不同妊娠时期可能具有特定功能，并在妊娠的建立和维持中发挥重要作用。而正常妊娠和病理妊娠胎盘组织中 的表达也不同。等 的研究显示，与正常妊生殖医学杂志 年月第 卷第期娠胎盘相比，子痫前期和胎儿宫内生长受限患者胎盘中 、和 等多种 表达改变，提示 可通过某些靶向基因调控滋养层细胞行为和功能，包括凋亡、迁移和侵袭等。例如子痫前期胎盘中高表达的 靶向作用于视黄醇结合蛋白，抑制滋养层细胞的增殖和侵袭。而另一些 则可能促进滋养层细胞的活动，在相关疾病中发挥相反作用。有研究发现，通过下调 依赖的 细胞免疫球蛋白粘液素雷帕霉素复合物通路，促进滋养层细胞的增殖和侵袭，进而有利于改善子痫前期状态。是 家族的成员，起源于 的 端。既往报道指出，通常在癌细胞中异常表达，对各种类型癌症的发展具有不同的影响，可作为肿瘤诊断的标志因子及治疗靶点 。例如，在人乳头状甲状腺癌组织和细胞系中的表达水平分别低于正常甲状腺组织和正常甲状腺细胞系，对于乳头状甲状腺癌细胞的生长和转移具有显著抑制作用。本研究发现滋养层细胞可表达 ，并且在不同滋养层细胞系中表达水平亦存在差异，提示 的表达与