SLE患者CD24-CD2...TORC1通路的相关性分析_黄金梅.pdf

新疆医学第 53 卷论著SLE 患者 CD24-CD20hiCD11c+B 细胞与 mTORC1 通路的相关性分析黄金梅，董志高，肖萍萍，王青青，苏俊男，陈旭艳*（厦门医学院附属第二医院血液风湿科 福建厦门 361021）基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目（科技类）（项目编号：JAT190838）。作者简介：黄金梅，女，硕士，主治医师，研究方向：风湿免疫病学的临床与实验研究。通信作者：陈旭艳，女，主任医师，研究方向：风湿免疫病学的临床与实验研究，E-mail：。摘要：目的分析特异 B 细胞与 mTORC1 信号通路中 PI3K、AKt、mTOR mRNA 表达量的相关性。方法收集 2020 年1 月-2021 年 6 月在厦门二院门诊或住院 SLE 患者 40 例及健康人 40 例的外周血、临床资料，用流式检测 SLE 患者特异表型的 B 细胞，对该 B 细胞的表达比例和临床活动指标进行相关性分析；用 qPCR 法测 mTORC1 信号通路中 PI3K、A Kt、mTOR 基因的表达水平，并分析其与该特异 B 细胞的相关性。结果初发未治 SLE 患者外周血中存在高比例的 CD24-CD20hiCD11c+特异性 B 细胞；特异性 B 细胞的表达比例与抗 dsDNA 定量、SLEDAI 积分、24 h 尿蛋白定量正相关（P 0.05）；特异性 B 细胞的表达比例与补体 C3、补体 C4 负相关（P 0.05）；SLE 组 PI3K、AKt、mTOR mRNA 的表达显著高于健康（P 0.05）；特异性 B 细胞的表达比例与 PI3K、AKt、mTOR mRNA 的表达量呈正相关。结论SLE 患者外周血中 CD24-CD20hiCD11c+特异性 B 细胞的比例显著增高，该特异性 B 细胞的表达比例可能与抗 dsDNA 定量、SLEDAI 积分、24 小时尿蛋白定量、补体 C3、C4 及 mTORC1 信号通路中 PI3K、AKt、mTOR mRNA 的表达量具有一定相关性。关键词：系统性红斑狼疮；特异性 B 细胞；mTORC1 信号通路；相关性分析中图分类号：R593.2文献标识码：A文章编号：10015183（2023）011605Correlation analysis aboutCD24-CD20hiCD11c+B cellexpressionwith mTORC1 pathwayin patients with systemic lupus erythematosusHUANG Jin-mei，DONG Zhi-gao，XIAO Ping-ping，WANG Qing-qing，SU Jun-nan，CHEN Xu-yan*（Department of Hematology and Rheumatology,TheSecond Affiliated Hospital of Xiamen Medical College,Xiamen,Fujian,361021,China）Abstract：ObjectiveTo analyze the correlation between proportion of thespecific B cell and mRNA expression levels of PI3K,AKt and mTOR in mTORC1 signaling pathway.MethodsPeripheral blood samples and clinical data of 40 cases including inpatientsand outpatientswith systemic lupus erythematosus and 40 healthy peopleat the second hospital of Xiamenfrom January of 2020 to June of2021 were collected.The proportion of CD24-CD20hiCD11c+B cells was determined by flow cytometry method.The associationsbetweenproportion of CD24-CD20hiCD11c+B cells and clinical indicators were analyzed by Spearman correlation analysis.The relative mRNAexpression levels of PI3K,AKT and mTORC1 in peripheral blood were measured with quantitative PCR（qPCR）technique.Theircorrelation with the specific B cells was analyzed.ResultsThe naive SLE patients have significant higher proportion of CD24-CD20hiCD11c+specific B cells in peripheral blood compared with healthy people.The proportion of specific B cells had positiveassociation withanti-dsDNA quantification,SLEDAI score,and 24-hour urine protein quantification（P 0.05）.The proportion ofspecific B cells had negative association with the level of complement C3and complement C4（P 0.05）.The mRNA expression of Akt,PI3K and mTOR in SLE group were higher than those in healthy group（P 0.05）.The proportion of specific B cells had positiveassociation withPI3K,AKt and mTOR（P 0.05）.ConclusionThe SLE patients had higher proportion of CD24-CD20hiCD11c+specific B cells in peripheral blood.The proportion of specific B cell may have correlation with anti-dsDNA quantification,SLEDAI score,24-hour urine protein quantification,level of complement C3 and complement C4,and expression levels of PI3K,AKt and mTOR mRNAin mTORC1 signaling pathway.Key words：Systemic Lupus Erythematosus；Specific B cell；MTORC1 signaling pathway；Correlation analysis第 53 卷第 1 期2023 年 1 月新疆医学XINJIANG MEDICAL JOURNALVol.53No.1January.2023第 1 期系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythemato-sus，SLE），为青年女性好发，是一种以免疫复合物形成、致病性自身抗体产生为特点，全身性、累及多脏器的自身免疫性疾病，如果不及时诊治或控制不佳,将导致脏器的不可逆损害，甚至导致死亡1，2，3，4。在 SLE 的发生发展中，B 细胞的功能紊乱及异常活化表现出显著的意义，但是否有特异表型的 B 细胞，该 B 细胞与临床指标、疾病活动度的相关性如何仍缺乏深入的研究及探索。本研究试想能否从SLE 患者中筛出具有特异表型的 B 细胞，分析该特异 B 细胞的表达水平与临床参数的相关性，检测系统性红斑狼疮患者中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路中信号传导分子的 mRNA 表达情况及其与特异性 B细胞的相关性如何，进一步探索 SLE 发病的可能分子机制。1 资料与方法1.1 一般资料本实验收集 2020 年 1 月-2021 年 6 月在厦门二院门诊或住院 SLE 患者 40 例，男 6 例，女 34例，年龄范围在 16 岁-56 岁，平均年龄为（31 8）岁，同时收集体检的健康人 40 例为对照组，男 10例，女 30 岁，年龄范围在 18 岁-55 岁，平均年龄为（339 岁），两组间性别构成比 P 值为 0.402，年龄间比较 P 值为 0.354，差异无统计学意义。SLE 的诊断按 ACR 制定的 1997 年版分类标准5。本研究方案经医院伦理学委员会批准，研究对象均知情同意并签署知情同意书。收集、整理 SLE 患者组和对照组的临床数据，如补体 C3、补体 C4、抗 dsDNA 抗体定量、24h 尿蛋白定量、反应蛋白、血沉、尿素氮、血肌酐等。1.2 方法1.2.1 外周全血单个核细胞分离往 4 ml 的 EDTA-K2 抗凝血加入相同量的0.9%氯化钠混匀；细胞分离液取 4ml加入到 15ml离心管中；再把混匀后的血慢慢加进去；600 g，室温离心 20min；将管内白膜层吸往另一 15ml 离心管，加入适量 0.9%氯化钠颠倒混匀，4，1500r/min，离心 8 min；弃掉上清液，然后与适量 0.9%氯化钠混匀后，4，1000r/min，离心 10min；最下层的沉淀物就是所要的目的细胞，把它平均分成两份，一份用于流式测表型，一份用于 qPCR 方法测 mTOR、PI3K、AKt mRNA 表达量。1.2.2 流式细胞术检测表型在 100ul 左右的 0.9%氯化钠中加入上述提取的 PBMCs、流式抗体，4，把它们震荡混匀，然后避光静置 30min；加入适量预冷的 0.9%氯化钠终止染色，震荡混匀，1000 r/min，离心 5 min；弃掉上层清液后与 0.5ml 的 0.9%氯化钠混匀；然后再放入流式机上检测细胞的表型。1.2.3 总 RNA 的提取及 cDNA 合成用 Trizol 法提目的细胞的 RNA，接着按说明书操作，使用逆转录试剂盒，把提取的 RNA 逆转录成cDNA，然后把合成好的 cDNA 放于-70的冰箱冻存。1.2.4 引物设计与合成引物序列是通过检索 NCBI 数据库，用 Oligo6.71 软件设计的。内参基因是-actin，它的引物序列是 F5-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3，R5-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3；PI3K 引物序列为F5-TCCCAGGTGGAATGAATGGC-3，R5-TTTAGCACCCTTTCGGCCTT-3；P-mTOR 引物序列为 F5-CTTATGGTGCGGTCCCTTGT-3，R5-GGTCACCTGAGGGTGAACTG-3；P-AKt 引物序列为 F5-GGACAAGGACGGGCACATTA-3，R5-CGACCGCACATCATCTCGTA-3。1.2.5 qPCR 方法检测 mTOR、PI3K、AKt mRNA 在SLE 组和对照组外周血细胞中的表达量按照 qPCR 试剂盒操作步骤，qPCR 在 ABI7500型荧光定量 PCR 仪上自动完成。每个标本均重复试验 3 次。荧光量由 Light Cycler 系统软件监测，该软件还可以计算它的 Ct 值。-actin 作为内参，用Ct 表示