lncRNA_SNHG3靶...巢癌细胞上皮间质转化的影响_蒋静.pdf

论著与临床研究 靶向调控 对卵巢癌细胞上皮间质转化的影响蒋静，张珂，王丽基金项目：年度湖南省卫生健康委科研课题（项目编号：）作者单位：湖南 长沙，湖南省妇幼保健院盆底专科作者简介：蒋静，毕业于南华大学，硕士研究生，主治医师，主要研究方向为卵巢肿瘤通信作者，：【摘要】目的 探究长链非编码 小核仁 宿主基因（）对卵巢癌细胞恶性生物学行为的调控机制。方法 体外培养人卵巢癌细胞株（、和）和正常卵巢上皮细胞（），将对数生长期的 细胞分为对照组、组、沉默组、组、过表达组、沉默 组、沉默 组。检测细胞中 、表达；双荧光素酶实验验证 和 的调控作用；法、划痕实验和 小室实验检测各组细胞增殖、迁移、侵袭能力；检测各组细胞中上皮间质转化（，）相关蛋白钙粘蛋白（）、钙粘蛋白（）、波形蛋白（）表达。裸鼠成瘤实验检测沉默 的 细胞体内生长情况；免疫组织化学法和 检测移植瘤组织中、和 、表达。结果与 细胞相比，卵巢癌细胞系中 表达增加，表达降低（.）。双荧光素酶实验结果证实，是 的靶基因。敲低 或过表达 可降低 细胞的增殖活性和迁移、侵袭能力以及、水平，升高 水平（.）；下调 可激活，减弱 沉默对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。体内实验结果显示，敲低 可抑制裸鼠移植瘤生长，并升高肿瘤组织中、表达，降低 表达（.）。结论敲低 可能通过上调，抑制，进而抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。【关键词】；卵巢癌；上皮间质转化【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：.，：【】（）（，）（），；中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期 ；，；（），（）；，（.），（.），（.），【】；由于缺乏特定的诊断标志物和成熟的早期诊断方法，卵巢癌被发现时约 都进展成了晚期，治疗极其困难。尽管辅助化疗改善了患者的预后，但由于诊断较晚和对化疗耐药，患者的生存率仍较低。近年来，长 链 非 编 码 （，）已被报道在卵巢癌的早期诊断和治疗中有广阔的应用前景。小核仁 宿主基因（，）是 家族的一员，被报道在卵巢癌组织 细胞中表达升高，且与卵巢癌的恶性程度和预后不良相关。然而，在卵巢癌中的潜在机制仍有待探索。研究表明，主要通过竞争性结合微小（，）调节靶基因表达参与卵巢癌进展。（）是在多种癌症中下调的 之一。据报道，在卵巢癌中，较低的 水平与卵巢癌患者的不良预后相关，过 表 达 可 通 过 抑 制 上 皮 间 质 转 化（，），抑制卵巢癌细胞生长和转移。通过生物信息学筛选，研究发现 是 的靶基因，并且在非小细胞肺癌中，可通过下调 加速癌细胞的增殖和侵袭。在卵巢癌中，是否为下调 的 致 癌 因 子 还 未 可 知。因 此，本 研 究 旨 在 探 讨 对卵巢癌细胞恶性生物学行为的调控机制。材料与方法 材材料料人 卵 巢 癌 细 胞 株（、和）和正常卵巢上皮细胞（）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：、；试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，货号：；靶向 沉默的小干扰（）和对照（）、模拟物（）和 对 照（）、抑 制 剂（）和对照（）由上海吉玛制药技术有限公 司 合 成；兔 源 一 抗 钙 粘 蛋 白（）（）、钙粘蛋白（）（）、波形蛋白（，）、（）、山 羊 抗 兔（）（）购自英国 公司。型荧光定量（）仪（美国应用生物系统公司）；倒置荧光显微镜（日本 公司）。方方法法 细胞培养人卵巢癌细胞系、和 以及正常卵巢上皮细胞系 于细胞培养箱中培养。当细胞融合度达到 时进行传代。实时荧光定量（）检测细胞中、的表达 试剂从细胞中提取总。使用 试剂盒将总（）逆转录成，以该 作为模板，在 仪上扩增。和 为内参，采用 法进行 、相对定量分析。表 用于 的引物序列基因名称引物序列（）正向：反向：正向：反向：正向：反向：正向：反向：双荧光素酶报告基因检测 使用 （：）预测 与 的 结 合 位 点。野 生 型（）报告质粒（）是通过将 序列全长克隆到位于 位点的 载体中生成的。通过定点 突 变 构 建 突 变 型（）报 告 质 粒（）。将 细胞（个细胞 孔）接种在 孔板中，使用 将、和 或 共转染。转染后 收获和裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统测量荧光素酶活性，并标准化为海肾荧光素酶活性。细胞分组和转染 将 细胞以 个细胞 孔的数量接种于 孔板中，分为对照组（不转染）、组（转染）、沉默组（转染）、组（转染）、过表达组（转染 ）、沉默 组（共转染 和）、沉默 组（共 转 染 和）。、模拟物 抑制剂及其阴性对照（）的转染由 进行。在 下孵育 后，收集细胞用于进一步分析，检测转染效率。细胞增殖实验 将转染后的各组细胞接种到 孔板中（个细胞 孔），在 下 细胞培养箱中培养。培养开始、第 天、第 天、第 天分别向细胞中加入 溶液（），继续培养。用酶标仪测定 处每孔的吸光度（）值。划痕实验检测细胞迁移在 孔板中接种转染后的 细胞，贴壁后用 微量移液器吸头尖端刮擦细胞单层，产生水平划痕，然后，将细胞在无血清培养基中孵育。在 和 时于倒置显微镜下在同一位置拍照记录划痕愈合能力，使用 软件量化细胞相对运动，计算划痕愈合率。划痕愈合率（）（划痕宽度 划痕宽度）实验检测细胞侵袭取转染后的各组 细胞，胰酶消化重悬后，细胞悬液加入上室（预铺有），下室加入 含胎牛血清的培养基。后，用棉签擦去上室未透过膜的细胞，多聚甲醛固定下层细胞，在室温下用 结晶紫染色 。最后，在光学显微镜下计数随机的 个视野中穿透膜的细胞数，取平均值。检测细胞 相关蛋白表达使用 裂解液从细胞中提取总蛋白。将等量的蛋白质进行电泳分离，然后转移到 膜上。将膜在 脱脂牛奶中封闭 后用 （）、（）、（）和（）在下孵育过夜。将膜与 二抗（）一起在室温下孵育 。电化学发光试剂显色。以 为内参，分析结果。裸鼠成瘤实验 裸鼠（体重 ，北京维通利华实验动物技术有限公司，），周龄，雌性，在无病原体条件下饲养，并随机分为 组：组和 组，每组 只。获得稳定转染 和 的 细胞悬浮于 溶液中（个细胞），取 细胞悬液（.）分别注射至 组和 组裸鼠皮下，每 测量 次肿瘤体积肿瘤体积（）（长径）（短径）。后，取出肿瘤组织并称重。取部分肿瘤组织，石蜡包埋、切片，进行免疫组织化学染色；用于分析、水平的剩余组织保存在冰箱中（具体操作同.）。免疫组织化学分析肿瘤组织切片经脱蜡、水化后，用 过氧化氢处理 ，然后用正常山羊血清封闭 。随后，将切片与一抗（）、（）在 下孵育过夜，然后在室温下用二抗孵育 ，显色，苏木精复染。光学显微镜下观察并拍照，用 .软件计算积分光密度（，）。统统计计学学方方法法采用 .软件分析数据，结果以 表示。两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用 检验。.为差异有统计学意义。结果 人人卵卵巢巢癌癌细细胞胞中中 、水水平平与 细 胞 相 比，卵 巢 癌 细 胞 中 表达增加，表达降低（均 .）；在 细胞系中的表达水平高于其他细胞系。基于上述实验结果，选择 细胞系进行进一步的生物学实验。见图。注：，.，.；（实验重复次数）图 不同人卵巢癌细胞系中 、表达水平 双双荧荧光光素素酶酶报报告告基基因因检检测测结结果果 数据库预测发现 包含 中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期 的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与 组相比，高表达明显降低了含 质粒细胞的荧光素酶活性（.），对含 质粒细胞的荧光素酶活性影响差异无统计学意义（.）；见图、表。图 与 的结合序列预测表 细胞中荧光素酶活性（）组别 组 组 值 值 注：为实验重复次数 转转染染后后各各组组 细细胞胞中中 、表表达达水水平平与 组相比，沉默组细胞中 表达降低，表达升高（.），过表达组细胞中 表达升高（.）；与 沉默组相比，沉默 组细胞中 表达降低（.）。见图。各各组组 细细胞胞的的增增殖殖活活性性转染 、，与 组相比，沉默组和 过表达组细胞的增殖活性降低（.）；与 沉默组相比，沉默 组细胞的增殖活性升高（.）。详见表。各各组组 细细胞胞的的迁迁移移能能力力与 组相比，沉默组和 过表达组细胞的划痕愈合率降低（.）；与 沉默组相比，沉默 组细胞的划痕愈合率升高（.）。见图。注：与 组相比，.；与 沉默组相比，.，图 各组 细胞中 、表达（，）注：与 组相比，.；与 沉默组相比，.，图 各组 细胞的划痕愈合率和穿膜细胞数 各各组组 细细胞胞的的侵侵袭袭能能力力与 组相比，沉默组和 过表达组穿膜细胞数减少（.）；与 沉默组相比，沉默 组穿膜细胞数增加（.）。见图、图。表 各组 细胞的增殖活性（，）组别增殖活性（）组 组 沉默组 组 过表达组 沉默 组 沉默 组 注：与 组相比，.；与 沉默组相比，.各各组组 细细胞胞中中 相相关关蛋蛋白白的的表表达达与 组相比，沉默组和 过表达组 水平升高（.），、水平降低（.）；与 沉默组相比，沉默 组 水 平 降 低（.），、水平升高（.）。见图。图 各组 细胞侵袭能力（实验）注：与 组相比，.；与 沉默组相比，.，图 各组 细胞中 相关蛋白表达水平 沉沉默默 对对裸裸鼠鼠移移植植瘤瘤生生长长的的影影响响与 组相比，组裸鼠第 和 时肿瘤体积和瘤重降低（.）；见图、下页表。裸裸 鼠鼠 移移 植植 瘤瘤 中中 、和和 、表表达达水水平平与组 相 比，组、表达升高（.），、表达降低（.），详见下页表。讨论失调的 与包括卵巢癌在内的多种癌症有关。是一种致癌，等的研究指出，在结直肠癌患者中 上调，其高水平与晚期肿瘤分期、淋巴结转移和预后不良有关。等的研究表明，敲低可抑制卵巢癌细胞的恶性表图 沉默 对裸鼠移植瘤生长的影响中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期表 沉默 对裸鼠移植瘤生长的影响（，）组别肿瘤体积（）瘤重（）组 组 值 值表 裸鼠移植瘤中、和、表达水平（，）组别（）（）组 组 值 值 型。本研究中，卵巢癌细胞中 表达远高于正常卵巢上皮细胞。体外实验表明敲低 可抑制卵巢癌细胞恶性表型，体内实验证实敲低 会减慢卵巢癌细胞的生长能力，与以往的研究结果一致。表明 在卵巢癌进展中至关重要。调节 的转录。在非小细胞肺癌中，可下调 加速癌细胞增殖和侵袭。在喉癌中，也上调，通过与 竞争性结合来调 节 喉 癌 细 胞 的 恶 性 行 为。在 卵 巢 癌 中，的低表达在以往研究中已得到证实。本研究通过 预测发现 与 之间存在结合位点，双荧光素酶报告基因检测证实 可与卵巢癌细胞中 相互作用。此外，在敲低 表达的卵巢癌细胞中检测到 表达上调。上调 可抑制卵巢癌细胞的恶性表型；且抑制 可减弱 沉默对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。这提示，可能通过调控 参与卵巢癌的发生发展。与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。过程的激活增强了肿瘤细胞侵入和转移到远处器官或组织的能力。向 转化是 激活的重要标志，据报道，在卵巢癌中 表达的降低使其获得更具侵袭性的表型，可导致原发肿瘤细胞扩散到腹膜液中；为细胞发生 的标志物。据报道，的上调可通过抑制 抑制骨肉瘤细胞的恶性表型。在本研究中，敲低卵巢癌细胞中 后，表达的上调伴随着的升高，和 的降低；且抑制 可激活，增强卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力，阻断 沉默对卵巢癌细胞恶性表型的抑制作用。这提示，可能通过下调，诱导卵巢癌细胞的，进一步启动肿瘤转移。综上所述，敲低 可通过上调，抑制，进而抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。本研究为 成为卵巢癌诊断、治疗和预后评估的潜在标志物提供了重要依据。但尚存在一些局限性，如未分析的下游靶基因或通路，在未来的研究中会进行补充。此外，是否能通过调控其他 影响卵巢癌的进展，仍需要进一步探究。【参考文献】，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（，），（）：，：，（）：，（）：（下转第 页），（）：，？，（）：，（）：，（，），（）：，（）：柏海燕，刘晓娟，刘茜桐，等 非整倍体筛查中囊胚形成时间与检测结果及妊娠结局的相关性研究 生殖医学杂志，（）：，：（，），（）：，（）（）（）：（，），（）：，：，（）：，：，（期缺失）：，：（，），（）：（收稿日期：实习编辑：陈郾霖）（上接第 页），：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，