miRNA-194-5p通...减少神经炎症降低脑卒中风险_王霞.pdf

8翟清，薛嘉睿，高家林，等.尿白蛋白排泄率与老年糖尿病视网膜病变的关系 J 中国老年学杂志，2019;39(11):2623-59Auyeung KK，Han QB，Ko JK.Astragalus membranaceus:a review ofits protectio against inflammation and gastrointestinal cancers J AmJ Chin Med，2016;44(1):1-2210马艳春，胡建辉，吴文轩，等 黄芪化学成分及药理作用研究进展J 中医药学报，2022;50(4):92-511赵晓华，顾成娟，朴春丽.黄芪、夜明砂、潼蒺藜治疗糖尿病视网膜病变经验-仝小林三味小方撷萃J 吉林中医药，2020;40(8):995-712余静，赵海岚，程凯尧，等.黄芪皂苷通过调控蛋白激酶 样内质网激酶途径抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬的研究 J 中国临床药理学与治疗学，2019;24(4):361-813谷新怡，刘爱伟，苏艳，等.黄芪在眼科疾病中的应用研究进展J 中国中医眼科杂志，2016;26(1):46-914尤良震，林逸轩，方朝晖，等.黄芪甲苷治疗糖尿病及其并发症药理作用研究进展 J 中国中药杂志，2017;42(24):4700-615段娜，戴丹，周灵，等.血栓通联合眼底激光对糖尿病视网膜病变黄斑水肿患者血清 NOS、VEGF 和 IL-6 的影响 J 河北医药，2016;38(18):2751-3，275716钟茜，姚小磊，梁文旺，等.增生性糖尿病视网膜病变患者房水中 VEGF 与 IL-6、IL-18 相关性研究 J 临床眼科杂志，2016;24(3):207-1017李宏哲，李才锐，孙曙光，等.IL-6 基因启动子区-572 C/G 多态性与大理白族 2 型糖尿病视网膜病变的关系 J 国际眼科杂志，2017;17(3):444-818季美霞，曾志复，官常荣，等.血清血管内皮生长因子及白介素8 在 2 型糖尿病视网膜病变患者中的水平及其临床意义 J 中国糖尿病杂志，2016;24(7):622-519陈建志，冼文光，符小林，等.2 型糖尿病患者血清中血管内皮生长因子、apelin 及血红素氧合酶-1 水平变化及其与糖尿病视网膜病变的相关性研究 J 中华眼底病杂志，2019;35(2):145-920李亚珂，娄迎阁，时贵阁，等.彩色多普勒成像在糖尿病视网膜病变患者中的应用价值 J 国际眼科杂志，2018;18(2):360-22021-11-17 修回(编辑杜娟)miNA-194-5p 通过减少神经炎症降低脑卒中风险王霞李美王冰陈秋菊李岩刘振元张文奇(衡水市人民医院(哈励逊国际和平医院)康复医学科，河北衡水053000)摘要 目的探讨 miNA-194-5p 通过减少神经炎症降低急性缺血性脑卒中风险。方法采集 72 例急性缺血性脑卒中(AIS)患者和 72 例无脑血管病健康志愿者外周血，用实时荧光定量聚合酶链反应(T-qPC)检测血清中 miNA-194-5p表达量。脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外细胞模型培养。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中炎症因子水平，采用 Western 印迹检测肿瘤坏死因子受体相关因子(TAF)6 蛋白表达。结果脑卒中患者血清中 miNA-194-5p 表达显著低于正常组(P0.05)。与正常组比较，在 LPS 诱导的 HUVECs 模型中 miNA-194-5p 的表达被显著抑制(P0.05)，但激活 miNA-194-5p 能够抑制 HUVECs 上清中白细胞介素(IL)-1、IL-6 和肿瘤坏死因子(TNF)-水平，与空白组对比，差异均有统计学意义(P0.05)。下调 miNA-194-5p 表达，HUVECs 上清中 IL-1、IL-6 和 TNF-水平被激活，与正常空白组对比，差异均有统计学意义(P0.05)。miNA-194-5p 与 TAF6 的荧光素酶表达量显著低于空白组与 TAF6 组。在激活miNA-194-5p 后，TAF6 mNA 表达量受到显著抑制。下调 TAF6 可显著减少下调 miNA-194-5p 对 HUVECs 上清中 IL-1、IL-6 和 TNF-水平的影响，与 miNA-194-5p 下调组对比，差异均有统计学意义。结论miNA-194-5p 能够通过抑制TAF6 表达，减少神经炎症，降低脑卒中风险，miNA-194-5p 有希望成为临床治疗脑卒中相关神经炎症的重要指标。关键词 miNA-194-5p;TAF6;神经炎症;脑卒中中图分类号 743.31 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0679-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.044基金项目:衡水市科学技术研究与发展计划项目(2017014045Z)通信作者:张文奇(1968-)，女，主任医师，主要从事康复医学相关研究。第一作者:王霞(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事康复医学相关研究。在血管风险高发、人口统计学巨变(老龄化、城市化)、生活方式欠佳(久坐、饮食)和经济快速发展的背景下，脑卒中的发病率、致残率、死亡率呈升高趋势，已成为威胁中老年人健康的一大公害1。急性缺血性脑卒中(AIS)作为一种危重的医学急症，其病因尚未确定，目前需要利用多种评估工具进行及时的评估，包括非对比头颅电子计算机断层扫描(CT)检查、磁共振成像(MI)评估量表，这些评估工具非常有效，但也有其局限性，比如对特定脑区的敏感性有限2。在 AIS 的治疗方面，脑卒中后4.5 h内静脉注射重组组织纤溶酶原激活剂仍是临床首选，而由于缺乏对院前脑卒中症状的快速识别，AIS患者的及时干预常常受到阻碍3。微小 NA(miNAs)被认为是重要的调节因子，可以作为人类疾病的诊断生物标志物或治疗靶976王霞等miNA-194-5p 通过减少神经炎症降低脑卒中风险第 3 期点，为研究潜在的新治疗方法提供了机会。很多研究表明 miNAs 可以通过调节血管生成参与 AIS 的形成4，5。miNA-194-5p 已经在多种癌症中得到了很好的研究，并且在顺式细胞癌患者中也被证实是下调的6。也有研究表明在低温氧葡萄糖剥夺处理的神经元中，miNA-194-5p 的表达显著下调，在miNA-194-5p 介导神经元死亡的调控种，其下调对特定靶蛋白 SUMO2 缺血耐受至关重要，miNA-194-5p 在通过调节 SUMO2 调节深低温循环停止反应中发挥独特作用。这些发现提示 miNA-194-5p可能是缺血性疾病干预治疗的潜在靶点7，8。然而，miNA-194 在 AIS 中的作用尚未见报道。mi-NA-194-5p 对 AIS 及其相关炎症的作用和机制尚不清楚。本研究旨在探索 miNA-194-5p 对 AIS 相关炎症的作用及其可能机制。1资料与方法1.1一般资料选取 2016 年 1 月至 2018 年 12 月衡水市人民医院神经内科就诊的 AIS 患者 72 例为脑卒中组，男 38 例，女 34 例，年龄 58 68 岁;同期72 例无脑血管病健康志愿者为正常组，男 37 例，女35 例，年龄 61 67 岁。纳入标准:临床确诊为AIS，入院前行头部 CT 排除脑出血;临床资料完整;首次发病且于 3 d 内入院。排除标准:发病前有颅脑或精神创伤者及合并其他神经系统疾病;年龄18 岁;颅内出血或合并梗死后出血;合并肿瘤及心肺功能不全;合并自身免疫性疾病。取血样，4离心10 min，得血清，80保存。经 CT或 MI 检查证实为 AIS。本研究经医院伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意。1.2实时荧光定量聚合酶链反应(T-qPC)使用 TIzol 试剂(Invitrogen;Thermo Fisher Scientific，Inc)，从血清和细胞中收集总 NA。运用 T 试剂盒(TaKaa Bio，Inc)合成 cDNA。反应在20 l 体积内进行，每个基因包含 1 l 引物(10 mol/L)、1 lcDNA、10 l SYB Premix EX TaqTM(Takara Bio，Inc)和 8 l 无核糖核酸酶水。T-PC 使用 Light-Cycle96 装置(罗氏，中国上海)进行。用 2Ct法分析 mNA 表达量。1.3细胞培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国 Ambion 公司。HUVECs 在含有 10%胎牛血清(FBS)的 DMEM 中生长，细胞在 37 和 5%CO2下孵育。使用 Lipofectamine2000 试剂(Invitrogen;Thermo Fisher Scientific，Inc)，miNA-194-5p、simi-NA-194-5p、siTAF6 和对照质粒(上海基因制药有限公司)转染 HUVECs。细胞分为正常组和脂多糖(LPS)模型组，培养 48 h 后，将 100 ng/ml LPS 加入 LPS 诱导组 HUVECs 中，孵育 48 h，建立 LPS 诱导的 HUVECs 模型，并检测 6、12、24、48 h 的 mi-NA-194-5p 表达。将 LPS 诱导培养 48 h 的 HU-VECs 分为空白组、miNA-194-5p 组、simiNA-194-5p 组，分别转染相应的质粒，培养 12 h 后，检测miNA-194-5p、炎症因子、TAF6 mNA、TAF6 蛋白表达情况。将 LPS 诱导培养 48 h 的 HUVECs分为空白组，simiNA-194-5p 组，simiNA-194-5pa+siTAF6 组，分别转染相应的质粒，培养 12 h 后，检测 TAF6、炎症因子表达。1.4双荧光素酶报告分析使用了 miNA 靶点预测软 件 分 析 miNA-194-5p 的 作 用 靶 点。确 定TAF6 的 3-UT 与 miNA-194-5p 的结合位点。使用 Lipofectamine2000(Invitrogen;Thermo FisherScientific，Inc)诱导 HUVECs 转染 TAF6-miNA-194-5p 和 TAF6-negative。转染 24 h 后，使用双荧光素酶分析系统进行报告分析。1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA 试剂盒用于细胞上清中炎症因子白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-水平检测。使用 FLU-Ostar-Omega 微孔板阅读器(BMG-Labtech 股份有限公司)在 450 nm 波长处检测吸光度。1.6Western 印迹分析使用 IPA 裂解缓冲液提取总蛋白。然后在 10%的凝胶上用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质(50 g/ml)，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。随后，在室温下用 5%脱脂奶粉封闭膜 1 h，用(TAF)6 和 GAPDH 抗体在 4孵育 12 h。然后用辣根过氧化物酶结合的抗兔 IgG 二级抗体孵育膜2 h。使用增强化学发光试剂盒(EMD Millipore)对蛋白质条带进行可视化，并使用密度测定法(QuantityOne 4.5.0 软件;Bio-ad Laboratories，Inc)对蛋白进行定量。实验重复 3 次。1.7统计学方法采用 SPSS18.0 软件进行 t 检验，方差分析和 Tukey 检验。2结果2.1miNA-194-5p 在脑卒中患者血清的表达脑卒中组 miNA-194-5p 表达(0.390.15)显著低于正常组(1.000.08，P0.05)。2.2LPS 诱导的 HUVECs 中 miNA-194-5p 的表达与正常组相比，LPS 模型组各时间点 miNA-194-5p 表达水平显著下降(均 P0.001)。见表 1。086中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷表 1LPS 诱导 HUVECs 中 miNA